離心技術(shù)的應(yīng)用

　　由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過長，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

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　　等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P時(shí)粒子上?。辉趶濏斕帵?SUB>P＞ρ_m時(shí)，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此時(shí)dx/dt為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。

　　此法一般應(yīng)用于物質(zhì)的大小相近，而密度差異較大時(shí)。常用的梯度液是CsCl。

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　?、碧荻炔牧系倪x擇原則作為一種理想的梯度材料應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。③不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對(duì)于超速離心分析工作來說，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。

　　⒉梯度材料的應(yīng)用范圍

　?、耪崽牵核苄源螅再|(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。

　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。

　?、锹然C：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。

　?、塞u化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

　?、蒔ercoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。

　　三、分析性超速離心

　　與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結(jié)構(gòu)，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉(zhuǎn)子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質(zhì)在一個(gè)離心場中的沉降過程。

　　（一）分析性超速離心的工作原理

　　分析性超速離心機(jī)主要由一個(gè)橢圓形的轉(zhuǎn)子、一套真空系統(tǒng)和一套光學(xué)系統(tǒng)所組成。該轉(zhuǎn)子通過一個(gè)柔性的軸聯(lián)接成一個(gè)高速的驅(qū)動(dòng)裝置，此軸可使轉(zhuǎn)子在旋轉(zhuǎn)時(shí)形成自己的軸。轉(zhuǎn)子在一個(gè)冷凍的真空腔中旋轉(zhuǎn)，其容納二個(gè)小室：分析室和配衡室。配衡室是一個(gè)經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉(zhuǎn)子中，其工作原理與一個(gè)普遍水平轉(zhuǎn)子相同。分析室有上下二個(gè)平面的石英窗，離心機(jī)中裝有的光學(xué)系統(tǒng)可保證在整個(gè)離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質(zhì)，可以通過對(duì)紫外光的吸收（如對(duì)蛋白質(zhì)和DNA）或折謝率的不同對(duì)沉降物進(jìn)行監(jiān)視。后一方法的原理是：當(dāng)光線通過一個(gè)具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產(chǎn)生光的折射。在分析室中物質(zhì)沉降時(shí)重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個(gè)折射的透鏡，結(jié)果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)出一“峰”。由于沉降不斷進(jìn)行，界面向前推進(jìn)，故“峰”也在移動(dòng)，從峰移動(dòng)的速度可以得到物質(zhì)沉降速度的指標(biāo)。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。

　?。ǘ┓治鲂猿匐x心的應(yīng)用

　?、睖y定生物大分子的相對(duì)分子重量測定相對(duì)分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應(yīng)用最廣的是沉降速度，超速離心在高速中進(jìn)行，這個(gè)速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉(zhuǎn)的中心輻射地向外移動(dòng)，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個(gè)明顯的界面，該界面隨時(shí)間的移動(dòng)而移動(dòng)，這就是粒子沉降速度的一個(gè)指標(biāo)，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。

　　分子或粒子的相對(duì)分子重量則可從Svedberg方程式來確定：

圖16-5　分析性超速離心系統(tǒng)圖示

　　式中M：該分子不含水的相對(duì)分子重量；R：氣體常數(shù)；T：絕對(duì)溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當(dāng)一克溶質(zhì)加到一個(gè)大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。

　?、采锎蠓肿拥募兌裙烙?jì)靜分析性超速離心已廣泛地應(yīng)用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質(zhì)的純度。用沉降速度的技術(shù)來分析沉降界面是測定制劑均質(zhì)性的最常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認(rèn)為是均質(zhì)的，如有雜質(zhì)則在主峰的一側(cè)或二側(cè)出現(xiàn)小峰。

　　⒊分析生物大分子中的構(gòu)象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構(gòu)象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質(zhì)上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機(jī)溶劑）DNA分子可能發(fā)生一些構(gòu)象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構(gòu)象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實(shí)。