現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)用谷丙轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)生物傳感器研究

　　何保山，周愛玉，李華清，岳偉偉，羅金平，蔡新霞

　　(1.中國(guó)科學(xué)院 電子學(xué)研究所傳感技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080；2.中國(guó)科學(xué)院 研究生院，北京 100080)

　　1 引言

　　ALT也稱作丙胺酸氨基轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于機(jī)體內(nèi)各器官組織中。在肝、心、腎、胰、腦、肺、肌肉、骨骼等器官組織細(xì)胞中，都含有不同程度的ALT，但以肝臟含量為最多，存在于肝細(xì)胞漿中。ALT主要代謝功能是可以催化丙胺酸和α-酮戊二酸可逆轉(zhuǎn)換成丙酮酸和谷氨酸。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，大量的ALT就會(huì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中，升高的ALT酶活被認(rèn)為是肝細(xì)胞損傷的最特異性標(biāo)志物之一。

　　我國(guó)衛(wèi)生部規(guī)定，血清ALT檢驗(yàn)足獻(xiàn)血員健康體檢必查項(xiàng)目之一，同時(shí)規(guī)定獻(xiàn)血者的血液ALT檢測(cè)方法采用賴氏法或全自動(dòng)生化儀的速率法。但這兩種方法存在的主要問題是賴氏法耗時(shí)長(zhǎng)，準(zhǔn)確性差，受主觀因素影響大。而速率法雖然準(zhǔn)確，但儀器龐大，價(jià)格昂貴，需專業(yè)人士操作。面對(duì)現(xiàn)在街頭無(wú)償獻(xiàn)血者因血清ALT高造成大量不必要的獻(xiàn)血和血液浪費(fèi)問題，非常有必要建立一種快速靈敏、準(zhǔn)確方便的ALT檢測(cè)方法，這將對(duì)開展血清中ALT研究和“窗口期”肝炎預(yù)防具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

　　基于光的吸收／反射原理和酶促反應(yīng)原理，本文介紹了一種新型的谷丙轉(zhuǎn)氨酶光學(xué)生物傳感器，將反應(yīng)底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，這種傳感器可以用于血清ALT的快速檢測(cè)，制作簡(jiǎn)單，成本低，適于一次性使用，在血液篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。

　　2 實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1 試劑

　　丙胺酸、α-酮戊二酸、谷丙轉(zhuǎn)胺酶(ALT，EC2.6.1.2，from porcine heart，84 U／mg)、丙酮酸氧化酶(PyOD，EC1.2.3.3，8.9 U／mg)、磷酸緩沖鹽片(PBS，0.01 mol／L，pH 7.4)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶(POD，EC1.11.1.7，fromGrade I，horseradish，250 U／mg)購(gòu)自德國(guó)Roche公司；3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、硫酸鎂、磷酸鈉購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純，溶液皆用去離子水配制，最終調(diào)節(jié)溶液pH值為7.4。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。

　　血清樣本由北京醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心和北京市紅十字血液中心提供。

　　2.2 檢測(cè)原理

　　利用光的吸收／反射原理塒血清中ALT進(jìn)行快速檢測(cè)。首先血清中ALT催化丙胺酸和α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化生成丙酮酸和谷氨酸，丙酮酸在磷酸根和丙酬酸氧化酶的作用下氧化生成乙酰磷酸和過(guò)氧化氫，生成的過(guò)氧化氫具有強(qiáng)氧化性，可以將還原性的指示劑3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)氧化生成藍(lán)色化合物，致使敏感膜發(fā)生顏色變化。敏感膜顏色的深淺與過(guò)氧化氫的量直接相關(guān)，而過(guò)氧化氫又只與樣本中ALT的含量相關(guān)，因此通過(guò)光分析系統(tǒng)靈敏感知敏感膜顏色的變化即可得知樣本中ALT的含量，反應(yīng)原理為

　　2.3 ALT光學(xué)生物傳感器的制備

　　本新型光學(xué)生物傳感器由敏感膜、保護(hù)膜和基底三部分組成，分別由劃片機(jī)切割成所需尺寸，用粘合劑粘結(jié)成形(如圖1所示)。其中敏感膜用配好的反應(yīng)試劑和指示劑先后滴加其上，置于室溫風(fēng)干，最后封蓋透明保護(hù)膜即可備用。

　　2.4 傳感器系統(tǒng)組成及測(cè)量方法

　　圖2為傳感器系統(tǒng)組成的框圖。以帶有數(shù)據(jù)傳輸接口的微處理器為中樞，通過(guò)數(shù)模接口向SP62光源發(fā)送調(diào)制信號(hào)?？刂乒庠丛陬A(yù)定的條件下啟動(dòng)，通過(guò)模數(shù)接口自動(dòng)讀取特定波長(zhǎng)下的光信號(hào)，并即時(shí)顯示數(shù)據(jù)結(jié)果。

　　測(cè)試時(shí)取血清試樣10 μL滴加在敏感膜的中央，啟動(dòng)儀器檢測(cè)，同時(shí)計(jì)時(shí)開始，待試樣擴(kuò)散均勻后，封蓋透明保護(hù)膜，將傳感器插入測(cè)試儀器，約60 s，自動(dòng)讀取光信號(hào)值，依據(jù)預(yù)先置入的反射值與ALT濃度的響應(yīng)關(guān)系，即可定量檢測(cè)血清中ALT的含量。

　　3 結(jié)果與討論

　　圖3所示的是不同濃度ALT在可見光區(qū)域內(nèi)的全波長(zhǎng)掃描圖。其中a，b，c，d，e對(duì)應(yīng)的ALT濃度分別為1000，500，250，100，25 U／L。由圖中可以看出，當(dāng)傳感器加入ALT后，波長(zhǎng)為400～700nm，生成的藍(lán)色產(chǎn)物在波長(zhǎng)660 nm處出現(xiàn)了特異性的吸收，并且隨著ALT濃度N的增加，傳感器敏感膜藍(lán)色加深，光吸收增強(qiáng)，波長(zhǎng)660 nm處反射值逐漸降低，這說(shuō)明本光學(xué)生物傳感器在660 nm處分辨率最好，靈敏度也最高，這與監(jiān)色物質(zhì)對(duì)白光的吸收／反射特性是一致的。

　　實(shí)驗(yàn)表明樣本中ALT濃度N和波長(zhǎng)660 nm處反射值是線性相關(guān)的。圖4是利用ALT光學(xué)生物傳感器檢測(cè)人體血清的響應(yīng)關(guān)系圖。血清樣本由北京市紅十字血液中心提供，在20～150 U／L均勻選擇6個(gè)樣本，每個(gè)樣本測(cè)試3次，檢測(cè)時(shí)間60 s。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在20～150 U／L內(nèi)，血清ALT濃度N和反射值表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系y=0.0372x+66.055，R=0.987，線性相關(guān)系數(shù)為0.987，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血清ALT的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

　　4 結(jié) 論

　　盡管對(duì)患有肝病病人的診斷中ALT具有非常重要的臨床意義，但很少有可用于肝病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷的傳感器出現(xiàn)。2003年，G．S．Xuan等人報(bào)道了一種固定有ALT抗體的電化學(xué)免疫傳感器，雖然此傳感器系統(tǒng)對(duì)ALT表現(xiàn)出優(yōu)良的檢測(cè)速度和精度，但它的形式結(jié)構(gòu)卻比較復(fù)雜，檢測(cè)上限受到抗體特性的限制。本文基于光的吸收／反射原理和酶促反應(yīng)原理提供了一種新型的ALT光學(xué)生物傳感器，反應(yīng)底物和指示劑依次固定在敏感膜中制作成生物傳感器，其血清ALT檢測(cè)時(shí)間60 s，檢測(cè)范圍20～150 U／L，線性相關(guān)系數(shù)為0.987。并且這種生物傳感器制作簡(jiǎn)單，耗樣少(10 μL)，一次性使用，避免交叉感染，具有良好的臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。