非成像式流式細(xì)胞儀的發(fā)展與應(yīng)用

　　流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）也稱(chēng)為熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)（Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS） ，是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處在快速、直線(xiàn)、流動(dòng)狀態(tài)中的單細(xì)胞或者生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析，同時(shí)對(duì)特定群體加以分選的現(xiàn)代細(xì)胞分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer）是集激光技術(shù)、光電檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體的新型高科技儀器。它能夠高效檢測(cè)細(xì)胞大小、粒度、表面積等細(xì)胞結(jié)構(gòu)參數(shù)和細(xì)胞表面 / 胞質(zhì) / 核的特異性抗原、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、酶活性、Ca2+、細(xì)胞活性等細(xì)胞功能參數(shù)， 同時(shí)還具有細(xì)胞分選和計(jì)數(shù)能力。自上世紀(jì)70年代第一臺(tái)流式細(xì)胞儀問(wèn)世以來(lái)，歷經(jīng) 40 多年的迅猛發(fā)展，目前流式細(xì)胞儀已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、藥理學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)以及細(xì)胞凋亡檢測(cè)和臨床檢驗(yàn)等領(lǐng)域。

　　1? 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)

　　流式細(xì)胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)和細(xì)胞分選系統(tǒng) 4 部分組成。經(jīng)過(guò)特定熒光染色的待測(cè)樣本細(xì)胞懸液，在鞘流的包圍約束下，細(xì)胞成單列排布，由流動(dòng)室噴嘴高速?lài)姵?，形成?xì)胞液柱。液柱與激光束垂直相交，相交位置即為檢測(cè)區(qū)，在入射激光照射下產(chǎn)生熒光信號(hào)和前向散射光信號(hào)（FSC，F(xiàn)orward Scatter）與90°側(cè)向散射光信號(hào)（SSC，Side Scatter） ，可被電子系統(tǒng)檢測(cè)并輸入到計(jì)算機(jī)利用專(zhuān)業(yè)軟件進(jìn)行細(xì)胞多參數(shù)分析與分選。

　　1.1? 液流系統(tǒng)

　　液流系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)將待測(cè)樣品從樣品室運(yùn)送到流動(dòng)室的測(cè)量區(qū)域，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心，并且在一次曝光時(shí)間內(nèi)，只允許一個(gè)細(xì)胞通過(guò)激光束，然后根據(jù)需要，液流流入廢液桶或者分選收集管。液流系統(tǒng)主要由流動(dòng)室和液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)構(gòu)成。流動(dòng)室內(nèi)充滿(mǎn)鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的包圍下，細(xì)胞排成單列從流動(dòng)室的噴嘴流出，并且被鞘液包圍形成細(xì)胞液柱。另外，同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流（核流）和鞘流始終保持分層鞘流的狀態(tài)。

　　1.2? 光學(xué)系統(tǒng)

　　光學(xué)系統(tǒng)負(fù)責(zé)產(chǎn)生并采集熒光、散射光信號(hào)，主要由包括激光、光纖、光束形成棱鏡、聚焦鏡的光學(xué)激發(fā)系統(tǒng)和包括熒光物鏡、光纖、光學(xué)濾片、檢測(cè)器的光學(xué)采集系統(tǒng)組成。目前流式細(xì)胞儀廣泛使用的是 488nm 的氬離子激光器和 635nm 的氦 - 氖激光器。光學(xué)濾光片放置在光電倍增管前面，對(duì)去除干擾信號(hào)、提高結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

　　1.3? 電子系統(tǒng)

　　電子系統(tǒng)的功能是將熒光和散射光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)， 并進(jìn)行數(shù)字化處理后送入計(jì)算機(jī)用專(zhuān)用軟件進(jìn)行分析，包括光電轉(zhuǎn)化器、信號(hào)放大器、信號(hào)處理系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)軟件分析系統(tǒng)。液柱中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)測(cè)量區(qū)域被激光照射，產(chǎn)生熒光信號(hào)和前向角散射與 90°側(cè)向角散射信號(hào)。其中熒光信號(hào)由光電倍增管檢測(cè)，2 個(gè)散射光信號(hào)由光電二極管檢測(cè)。熒光信號(hào)與產(chǎn)生熒光的化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，前向散射光信號(hào)與細(xì)胞大小有關(guān)，90°側(cè)向散射光信號(hào)與細(xì)胞粒度有關(guān)。通過(guò)安裝多個(gè)濾光片和不同波長(zhǎng)的激光器就能得到更多的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)，這對(duì)于人們認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的相互作用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

　　1.4? 分選系統(tǒng)

　　利用流動(dòng)室噴嘴上的高頻壓電晶體的振動(dòng)，將液流變成只包含單個(gè)靶細(xì)胞的小液滴，系統(tǒng)根據(jù)鞘流的流速與晶體振動(dòng)的頻率，精確算出小液滴的間距，然后對(duì)其施加相應(yīng)的電壓，當(dāng)小液滴通過(guò)正負(fù)極板時(shí)就會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，流入相應(yīng)的收集管里， 不帶電的液滴就會(huì)流入中間的廢液桶里，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞（ 包括中性粒細(xì)胞 ） 的分選 　　。

　　2? 流式細(xì)胞儀的最新進(jìn)展

　　2.1? 光學(xué)系統(tǒng)的完善

　　隨著激光技術(shù)的發(fā)展，激光器的性能更加優(yōu)異，價(jià)格也更加低廉，這使得激光逐漸取代非相干光源，在流式細(xì)胞儀中得以廣泛應(yīng)用。目前，除德國(guó)的Partec 等公司的部分產(chǎn)品仍使用汞燈作為光源激發(fā)紫外的熒光物質(zhì)外，多數(shù)的流式細(xì)胞儀都配備多個(gè)激光器，同時(shí)發(fā)出不同波長(zhǎng)的激光以激發(fā)出多種熒光。例如BD 公司的 FACSAria 流式細(xì)胞分選儀除配備較為常用的488nm藍(lán)光和640nm紅光外，還配備 407nm 光源。同時(shí)，染料激光器的出現(xiàn)，使得光源發(fā)出連續(xù)可調(diào)的光譜成為可能，極大地?cái)U(kuò)展波長(zhǎng)范圍，可以滿(mǎn)足用戶(hù)多種特殊的需求。另外，通過(guò)配備多個(gè)光學(xué)濾光片，可同時(shí)檢測(cè)多種熒光信號(hào)和包括 FSC 和 SSC 在內(nèi)的信號(hào)，豐富人們的視野，更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的檢測(cè)。

　　2.2? 靈敏度和分辨率的提高

　　靈敏度反映儀器能夠檢測(cè)到最弱的熒光和散射光信號(hào)，直接決定能否檢測(cè)出待檢測(cè)指標(biāo)。靈敏度主要與待檢測(cè)物體被激光照射效率和熒光接收效率有關(guān)，靈敏度的高低也是衡量流式細(xì)胞儀性能的最重要指標(biāo)之一 ［4］。通過(guò)使用更加貼近最大吸收波長(zhǎng)的激發(fā)光源和改善光路系統(tǒng)設(shè)計(jì)能夠有效提高流式細(xì)胞儀靈敏度，同時(shí)，使用較高靈敏度的光電檢測(cè)元件也可以分析微弱的熒光信號(hào)，較大程度上提高流式細(xì)胞儀靈敏度。目前流式細(xì)胞儀多使用石英微流動(dòng)室 和數(shù)值孔徑較大的物鏡，使得收集到的細(xì)胞熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。另外，通過(guò)使用光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)，也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一些微弱熒光信號(hào)的檢測(cè)。光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)具有較高靈敏度，但是檢測(cè)面積比較小，使用時(shí)應(yīng)該用高質(zhì)量的透鏡組將光子匯聚到它的有效面積上。隨著熒光技術(shù)的發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)更多類(lèi)型的熒光染料可供選擇，熒光的激發(fā)光強(qiáng)也有很大的提高， 實(shí)現(xiàn)靈敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纖，也能夠更好地與光源、光電檢測(cè)器和芯片耦合，顯著降低光強(qiáng)損失，提高儀器靈敏度。