理想的三聚氰胺檢測方法
加入技術(shù)交流群
樣品制備
三個(gè)不同的牛奶樣品——天然的全脂牛奶、脫脂牛奶以及天然奶粉制成的人造奶——加入純的三聚氰胺。這三種不同的乳制品與三聚氰胺儲(chǔ)備液（濃度為2mg/mL的蒸餾水溶液）混合制成加標(biāo)樣品。三種牛奶均加入20及100礸/L的三聚氰胺，全脂和脫脂牛奶樣品另外再加入濃度為550及1,000礸/L的三聚氰胺。
對(duì)于第一種檢測試劑盒，加標(biāo)牛奶樣品按試劑盒操作方法進(jìn)行制備：
◆在潔凈試管中加入大約1mL加標(biāo)牛奶樣品；
◆樣品在1,500 g、10 ℃下離心10分鐘；
◆取脂肪層下部分200礚轉(zhuǎn)入潔凈試管中；并且牛奶乳清中加入800礚檢測稀釋液，仔細(xì)混合稀釋樣品。
對(duì)于第二種試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商直接提供的信息，對(duì)樣品的制備方法稍加調(diào)整，以提高檢測靈敏度。如果根據(jù)原有的說明制備牛奶樣品，會(huì)發(fā)現(xiàn)三聚氰胺檢測靈敏度低于第一種方法，因?yàn)楦鶕?jù)原有的說明檢測樣品被稀釋過量：
◆潔凈試管中加入大約1mL加標(biāo)牛奶；
◆樣品在1,500g、10 ℃下離心10分鐘，分成3層；
◆取中層250礚，轉(zhuǎn)入潔凈試管中；并且
◆取出液體以1:3的比例加入10%的甲醇/PBS溶液（20mM）。
“經(jīng)典的ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）測量可以作為一個(gè)理想的解決方案。這種方法可以在微孔板中進(jìn)行，因此樣品數(shù)量較多時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行，儀器成本也不高?！?
兩種ELISA試劑盒的使用都參照生產(chǎn)商的說明?？贵w包被的微孔中加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品或加標(biāo)樣的加入量為100或150礚（取決于試劑盒）。隨后每一個(gè)微孔中加入50礚 HRP——三聚氰胺標(biāo)記物，混勻微孔板并在室溫孵育30分鐘。蒸餾水沖洗去除未結(jié)合的樣品。300 礚蒸餾水重復(fù)沖洗4次。100礚 HRP——底物分裝入每一個(gè)微孔中，微孔板在室溫下再次孵育20或30分鐘（取決于試劑盒）。加入100礚終止液終止反應(yīng)，使用六種不同的酶標(biāo)儀在450nm測定吸收值。制作校準(zhǔn)曲線，用于確定未知濃度。（該曲線可以根據(jù)吸收值或是準(zhǔn)確值進(jìn)行計(jì)算，空白對(duì)照的吸收值被設(shè)定為100%。）
校準(zhǔn)曲線及檢驗(yàn)靈敏度
利用第一種試劑盒制作的三聚氰胺校準(zhǔn)曲線，使用了六種不同型號(hào)的酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。計(jì)算第二種試劑盒的校準(zhǔn)曲線時(shí)，只使用了兩種酶標(biāo)儀。以前的數(shù)據(jù)顯示檢測儀對(duì)結(jié)果沒有影響。該方法的檢測限（LOD），是使用標(biāo)準(zhǔn)IUPAC 3*SD方法，根據(jù)校準(zhǔn)數(shù)據(jù)以及空白對(duì)照樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。
這些方法所需的測量范圍，與所有酶標(biāo)儀具有良好準(zhǔn)確度的波長范圍一致。這些方法的檢測限在很大程度上取決于測光讀數(shù)儀的準(zhǔn)確度和精確度。因此，LOD值之間僅存在極小的不具備顯著性的差異。對(duì)于兩種試劑盒，低于10 礸/L的三聚氰胺濃度能夠輕易檢出。因此，ELISA方法檢測三聚氰胺的準(zhǔn)確度與LC/MS/MS相當(dāng)。
三聚氰胺的測定
三種不同的牛奶加入純的三聚氰胺，用兩種試劑盒進(jìn)行分析。采用一系列不同的光度計(jì)進(jìn)行測量。
數(shù)據(jù)表明，兩種試劑盒測定的酶活非常接近，回收率差異小于10%。此外，兩種試劑盒都存在一個(gè)相同的趨勢(shì)，即三聚氰胺高濃度樣品的濃度測量值稍偏低；不過，這對(duì)這些方法的使用不會(huì)產(chǎn)生影響，因?yàn)樗袠悠愤€會(huì)作為篩選檢測的高濃度陽性樣品進(jìn)行測定。因此，結(jié)果明確表明，ELISA檢測適合用于篩選，包括未知牛奶樣品中三聚氰胺的檢測。
根據(jù)前述結(jié)果，兩種測試都能用于準(zhǔn)確測定乳制品中三聚氰胺的殘留量。測試的靈敏度與質(zhì)譜分析的靈敏度相當(dāng)。不過，與色譜方法相比，ELISAs具有成本方面的優(yōu)勢(shì)。這種簡便、高通量的篩選方法能夠以較低的儀器成本、適中的運(yùn)行價(jià)格，對(duì)上千個(gè)樣品進(jìn)行大規(guī)模的篩選。
雖然這些方法對(duì)牛奶樣品中高濃度三聚氰胺的測定值稍低，但是其靈敏度達(dá)到的水平依然適合對(duì)三聚氰胺進(jìn)行篩選，作出有/無的判斷。當(dāng)這些方法用于篩選時(shí)，陽性樣品隨后仍然需要使用LC/MS/MS 或 GC/MS/MS方法確定三聚氰胺的確切含量。
這種快速（總的檢測時(shí)間：大約1小時(shí)）并且具備成本效益的方法可以檢測牛奶中三聚氰胺的殘留量，從而對(duì)乳制品進(jìn)行高效的篩選，這確保了任何污染物都能被快速、簡便地發(fā)現(xiàn)。
評(píng)論