突變率提高23萬倍、可一天完成變異篩選，新型定向進(jìn)化系統(tǒng)或可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞 | 專訪易嘯

在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)化得到的蛋白質(zhì)，常常會(huì)因錯(cuò)誤的折疊修飾、分子間相互作用、錯(cuò)誤的細(xì)胞定位等因素，無法在復(fù)雜的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中正常工作。因此，開發(fā)能夠應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的定向進(jìn)化技術(shù)是一大趨勢。

“我們開發(fā)的 TADR 系統(tǒng)應(yīng)用范圍更廣，在大腸桿菌、酵母甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都有應(yīng)用潛力?！?易嘯說。

易嘯是中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所（以下簡稱為 “合成所”）研究員，博士師從明尼蘇達(dá)大學(xué)分子進(jìn)化學(xué)家 Antony Dean 教授學(xué)習(xí)種群遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)，并與其導(dǎo)師提出了生物多樣性的新理論，后期從理論轉(zhuǎn)向?qū)嶒?yàn)研究。他在博士后期間與工程生物學(xué)結(jié)緣。

今年 7 月，易嘯作為第一作者和并列通訊作者在 Science Advances 上發(fā)表最新研究成果。該團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)的方法開發(fā)了一個(gè) “智能” 細(xì)菌系統(tǒng) —— 靶向性人工 DNA 復(fù)制體（TADR），該系統(tǒng)能夠在活細(xì)胞內(nèi)將大量突變快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不會(huì)影響基因組的其他部分。

“TADR 系統(tǒng)將突變率提高了 23 萬倍，一天即可完成變異篩選，快速進(jìn)化基因。我們正在探索潛在應(yīng)用方向，比如說用該系統(tǒng)進(jìn)化指定的大分子或者抗體。” 易嘯

TADR 系統(tǒng)是易嘯在博士后期間的一個(gè)合成生物學(xué)項(xiàng)目。在博士后研究階段，易嘯花費(fèi) 5 年時(shí)間獨(dú)立設(shè)計(jì)開發(fā)出了 TADR 系統(tǒng)，并獲得了相關(guān)技術(shù)的美國專利。現(xiàn)在他已經(jīng)在合成所材料合成生物學(xué)中心成立了合成進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室的一大重點(diǎn)就是圍繞 TADR 系統(tǒng)展開基礎(chǔ)研究和探索應(yīng)用場景，解決科學(xué)和生產(chǎn)問題。 

易嘯坦言，現(xiàn)階段，TADR 系統(tǒng)是其在研究生涯過程中最有成就感的一項(xiàng)研究。

將突變率提高 23 萬倍，一天即可完成變異篩選

細(xì)胞外突變法是目前最為成熟且直觀的一種定向進(jìn)化方法，包括易錯(cuò) PCR（error-prone PCR）、易突變菌株（mutator strains of bacteria）以及可產(chǎn)生非隨機(jī)突變的定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）等。

然而，這種方法往往需要密集的人工操作，多數(shù)情況下只能在有限的突變庫上進(jìn)行一輪進(jìn)化。如果想要得到更有優(yōu)勢的蛋白質(zhì)，或者完成更復(fù)雜的定向進(jìn)化目標(biāo)，就需要更大體量的突變庫，以及進(jìn)行多輪迭代進(jìn)化。

為了突破這些瓶頸，加快進(jìn)化速度，更快獲得更復(fù)雜的進(jìn)化目標(biāo)，研究人員開始嘗試開發(fā)細(xì)胞內(nèi)突變方式。

易嘯團(tuán)隊(duì)開發(fā)的 TADR 系統(tǒng)就是一種細(xì)胞內(nèi)突變方法，整個(gè)進(jìn)化過程在活細(xì)胞里面完成。TADR 系統(tǒng)系統(tǒng)也叫最簡 DNA 復(fù)制體，是由三個(gè)蛋白質(zhì)組成的蛋白復(fù)合體，分別為噬菌體蛋白 CisA、細(xì)菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌體 DNA 聚合酶的出錯(cuò)性突變子。

該系統(tǒng)能夠在短時(shí)間內(nèi)把大量突變靶向指定的 DNA 上面，同時(shí)保留基因組其他部分的完整性。

具體來說，他找到了一種噬菌體，其在天然復(fù)制過程中有一個(gè)能夠特異性識(shí)別 30 堿基對(duì)序列的蛋白，識(shí)別以后，噬菌體就從該位點(diǎn)開始復(fù)制 DNA。所以他把出錯(cuò)率高的 DNA 聚合酶融合到了這個(gè)噬菌體的蛋白上，利用這個(gè)噬菌體的蛋白去把出錯(cuò)率高的 DNA 聚合體靶向到指定突變的 DNA 上游。

易錯(cuò) PCR 是一種簡便快速在 DNA 序列中隨機(jī)制造突變的方法，通過改變傳統(tǒng) PCR 反應(yīng)體系中的 Mg2+ 濃度、dNTP 的濃度比例、pH 值等，使堿基在一定程度上隨機(jī)引入錯(cuò)誤而創(chuàng)造序列多樣性文庫。這種方法的關(guān)鍵在于控制合適的突變頻率，較低的突變率能夠積累大部分的有益突變，而較高的錯(cuò)摻率則會(huì)產(chǎn)生中性突變或有害突變。

“與基于出錯(cuò) PCR 和體外質(zhì)粒構(gòu)建的傳統(tǒng)定向進(jìn)化方法相比，TADR 可以避免分子連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等效率極低的步驟，從而實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞內(nèi)快速連續(xù)進(jìn)化分子和細(xì)胞表型的潛力。” 易嘯說。

該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì) TADR 系統(tǒng)進(jìn)行了量化，研究表示，與野生型突變速率相比，TADR 的突變速率提高了約 23 萬倍，即 2.3*10^5。

易嘯表示，該系統(tǒng)可以快速找到非常低頻的有益突變，加速分子突變速率。比如說，使用傳統(tǒng)方法可能需要一個(gè)星期，利用 TADR 只需一天即可完成變異篩選。

該系統(tǒng)可能會(huì)與合成所大設(shè)施的功能結(jié)合起來，相當(dāng)于添加了一個(gè)分子突變的功能檔。易嘯透露，還需要在功能檔上加一個(gè)細(xì)菌生長培養(yǎng)的模塊。最終與大設(shè)施形成一個(gè)連續(xù)突變和大規(guī)模篩選的閉環(huán)，不斷繼續(xù)循環(huán)，能夠非?？焖僭趯?shí)驗(yàn)室里面進(jìn)化出我們想要的大分子。

操作簡單，應(yīng)用場景更廣

在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)突變領(lǐng)域，目前已有兩大成熟系統(tǒng)，一是哈佛大學(xué)劉如謙團(tuán)隊(duì)于 2011 年開發(fā)的噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化方法（phage-assisted continuous evolution，PACE），另一種方法是加州大學(xué)爾灣分校教授 Chang C. Liu 開發(fā)的一種正交 DNA 聚合酶 - 復(fù)制子系統(tǒng)（orthogonal DNA replication，OrthoRep）。

PACE 系統(tǒng)在許多蛋白質(zhì)進(jìn)化應(yīng)用中已經(jīng)得到了驗(yàn)證，但是只有與細(xì)菌中基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)時(shí)，PACE 系統(tǒng)才可以進(jìn)化給定的目標(biāo)蛋白。也就是說，給定的目標(biāo)蛋白只能在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)進(jìn)化，折疊不良或者需要翻譯后修飾都會(huì)妨礙利用 PACE 系統(tǒng)的進(jìn)化。 

與 PACE 系統(tǒng)類似，OrthoRep 系統(tǒng)對(duì)生物物種也有選擇性，需要與酵母增殖活動(dòng)相關(guān)，只能在酵母（真核細(xì)胞）中才能進(jìn)行功能性表達(dá)。

“這兩大系統(tǒng)在概念上實(shí)現(xiàn)了一定的創(chuàng)新，可以相應(yīng)解決一些問題，但是存在一定的局限性，很多分子進(jìn)化問題無法利用這兩個(gè)系統(tǒng)解決，應(yīng)用場景受限?！?易嘯說。

正是看到了這兩大系統(tǒng)各自存在的盲區(qū)，易嘯在博士后研究期間專注于開發(fā)一種可以在哺乳動(dòng)物甚至更多生物物種中使用的系統(tǒng)。

在論文中，易嘯利用合成生物學(xué)思路構(gòu)建了 TADR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，可以實(shí)現(xiàn)模塊化，比如說關(guān)閉 TADR 系統(tǒng)后，細(xì)胞和目標(biāo)質(zhì)粒仍然能夠繼續(xù)增殖。模塊化能力也提供了 TADR 擴(kuò)展到其他細(xì)胞類型甚至無細(xì)胞系統(tǒng)中的可能性。 

易嘯介紹，TADR 系統(tǒng)比前兩個(gè)系統(tǒng)操作更加簡單，更容易上手。從原理上講，它可能在酵母、甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速進(jìn)化，應(yīng)用場景很廣，幾乎沒有限制。 

“我的實(shí)驗(yàn)室接下來將會(huì)開展相關(guān)研究，把該系統(tǒng)應(yīng)用到不同的物種中，進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。” 易嘯繼續(xù)補(bǔ)充。

現(xiàn)階段，易嘯將該系統(tǒng)的應(yīng)用方向瞄準(zhǔn)了材料領(lǐng)域，現(xiàn)已與合成所材料合成生物學(xué)中心研究員鐘超進(jìn)行了深入交流。

“材料研究涉及到物理、化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)，而這些也恰恰是做進(jìn)化、篩選的基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)物理、化學(xué)、生物的交叉融合，這是一個(gè)比較新的應(yīng)用方向，我們可以在實(shí)驗(yàn)室快速進(jìn)化和篩選活體材料所需的性質(zhì)，加強(qiáng)現(xiàn)有材料性質(zhì)，甚至進(jìn)化出一些原本不存在的材料性質(zhì)。”

“合成所的學(xué)術(shù)氛圍就像年輕人共同創(chuàng)業(yè)”

今年是易嘯回到合成所成立實(shí)驗(yàn)室開展研究工作的第一個(gè)年頭，他于 2008 年本科畢業(yè)后赴美攻讀博士學(xué)位，加入合成所之前，他已經(jīng)在海外求學(xué) 12 載。

對(duì)于易嘯來說，TADR 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和開發(fā)工作也并非一帆風(fēng)順。

“在美國進(jìn)行博士后期間，我用了整整 5 年才開發(fā)出 TADR 系統(tǒng)。其中前 3 年半全部都在試錯(cuò)，而且失敗得一塌糊涂，TADR 系統(tǒng)最開始的設(shè)計(jì)和現(xiàn)在的設(shè)計(jì)幾乎完全不同，所以開發(fā)出的系統(tǒng)一直存在缺點(diǎn)。直到最后一年半時(shí)間，TADR 才開始達(dá)到預(yù)期，可想而知，我在前 3 年半時(shí)間面臨的一些困難和內(nèi)心的煎熬?！?易嘯回憶道。

在他看來，科研工作中總是會(huì)經(jīng)歷或大或小的挫折，我認(rèn)為在這期間最重要的是要對(duì)科研工作保持堅(jiān)持執(zhí)著的心態(tài)。

“作為一線科研人員，我們需要做一些科學(xué)探索工作，不斷探索人類未知的前沿領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)新概念，甚至顛覆一些陳舊的認(rèn)知。同時(shí)還需要有一定的社會(huì)關(guān)懷，制定與社會(huì)利益相關(guān)的遠(yuǎn)大目標(biāo)。” 易嘯說。

這一點(diǎn)也與中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院（以下簡稱深圳先進(jìn)院）“頂天立地” 的理念也不謀而合。即 “天” 是學(xué)問，“地” 是產(chǎn)業(yè)，“頂天立地” 理念貫穿于深圳先進(jìn)院十個(gè)所的發(fā)展始終，作為其中較為年輕且發(fā)展迅猛的研究所，合成所亦是如此。換言之，造物致知就是頂天，造物致用就是立地。

“ 合成所的學(xué)術(shù)氛圍很活躍，老師們也都很年輕，加入合成所就好像一幫年輕人共同去創(chuàng)業(yè)，大家一起去干一番自己的事業(yè)。” 易嘯坦言。

關(guān)于未來的發(fā)展規(guī)劃，易嘯將重點(diǎn)圍繞兩個(gè)研究方向：第一個(gè)方向是偏向于基礎(chǔ)科學(xué)研究，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化細(xì)胞，將統(tǒng)一進(jìn)化過程重復(fù) N 次，探索生命體的可能空間；第二個(gè)方向是基于 TADR 的工程應(yīng)用，在三年內(nèi)使該技術(shù)更成熟，未來可以讓蛋白質(zhì)工程、大分子開發(fā)人員等更多科研人員都可以用上 TADR 系統(tǒng)。

同時(shí)，觀鳥是易嘯的愛好之一，辦公桌上的望遠(yuǎn)鏡、單反相機(jī)都是他觀鳥的必備神器。最近易嘯老師會(huì)在深圳先進(jìn)院旁邊的大沙河公園中用無人機(jī)拍水鳥，“以鷺這種類型的鳥為例，在大沙河上基本都能夠找到，比如蒼鷺、大白鷺、小白鷺，夜鷺……”