湖南大學(xué)科學(xué)家研發(fā)新型DNA納米機器，攻克靶標(biāo)分子無法檢測等難題，對細(xì)胞內(nèi)低豐度miRNA實現(xiàn)精準(zhǔn)靈敏的原位檢測

“惟楚有才，于斯為盛?！?br />
湖南永州籍 80 后科學(xué)家黃晉，他的履歷從本科開始，就和湖南大學(xué)深深綁定。

本科和直博，均就讀于該?；瘜W(xué)化工學(xué)院，博士則由美國佛羅里達(dá)大學(xué)和湖南大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)，博士后兩年在國家留學(xué)基金委資助下，留學(xué)美國并獲得博士學(xué)位。

值得注意的是，做博后研究時，他再次回到湖南大學(xué)。從當(dāng)初化學(xué)化工學(xué)院的本科生，再到如今成為該學(xué)院的教授，20 年時光似乎“眨眼間”流過。

而他也成為了湖南大學(xué)岳麓學(xué)者、湖南省杰出青年基金獲得者以及教育部青年長江學(xué)者。

2021 年 12 月 22 日，黃晉團隊在 Nucleic Acids Research 上發(fā)表了一篇研究論文，題為《光控放大的FRET納米耀斑：時空可控的、mRNA 驅(qū)動的納米機器用于活細(xì)胞內(nèi)微小RNA的精準(zhǔn)、靈敏成像》（Photocaged amplified FRET nanoflares: spatiotemporal controllable of mRNA-powered nanomachines for precise and sensitive microRNA imaging in live cells）[1]，論文第一作者為李靜博士，黃晉擔(dān)任通訊作者。

該論文報道了一種時空可控的、細(xì)胞內(nèi)源分子驅(qū)動的 DNA 納米機器，解決了活細(xì)胞內(nèi)低豐度靶標(biāo)分子“測不到、測不準(zhǔn)”難題，實現(xiàn)了精準(zhǔn)、靈敏原位檢測細(xì)胞內(nèi)低豐度 miRNA 的目標(biāo)。

據(jù)悉，miRNA 在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中扮演著非常重要的角色，具有類似于致癌基因和抑癌基因的作用。

目前越來越多的數(shù)據(jù)表明：miRNA 的異常表達(dá)與人類疾病密切相關(guān)，被認(rèn)為是診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

因此，對于更好地理解其功能、以及疾病相關(guān)的調(diào)節(jié)機理上，可視化定量細(xì)胞內(nèi) miRNA 具有至關(guān)重要的意義。

然而，目前細(xì)胞內(nèi)低豐度 miRNA 原位檢測仍然面臨一些難題：

其一，miRNA 的部分內(nèi)在屬性欠佳，例如小尺寸、高同源性、低豐度、易降解等；

其二，由于復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，生物分子自發(fā)熒光探針易被非靶標(biāo)分子降解或者提早激活，導(dǎo)致檢測精準(zhǔn)度低比如會出現(xiàn)假陽性；

其三，由于細(xì)胞空間尺寸的局限性，細(xì)胞內(nèi)某些 miRNA 的豐度比較低，基于傳統(tǒng)的“一對一”信號觸發(fā)模式即一個靶標(biāo)觸發(fā)一個信號，會導(dǎo)致檢測靈敏度不足比如會出現(xiàn)假陰性。

針對活細(xì)胞內(nèi)原位檢測低豐度 miRNA 的精準(zhǔn)度和靈敏度低的難題，黃晉團隊開發(fā)出上述時空可控的、內(nèi)源性分子驅(qū)動的 DNA 納米機器，實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)低豐度 miRNA 的精準(zhǔn)、靈敏熒光成像。

一方面，他們通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET，fluorescence resonance energy transfer）比率型信號輸出，有效地避免了系統(tǒng)波動和化學(xué)干擾（例如：細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和 DNA 水解酶）帶來的假陽性信號。

同時，讓光照作為外界刺激物實時控制探針的初始活性，避免探針在內(nèi)吞或者運輸過程中，即在到達(dá)腫瘤位點之前，被提早激活，產(chǎn)生高的非特異性信號，借此提高了檢測精準(zhǔn)度。

另一方面，其巧妙地利用了內(nèi)源性、高豐度的 mRNA 分子作為驅(qū)動力，實現(xiàn)了“一對多”信號觸發(fā)模式，即一個靶標(biāo)觸發(fā)多個信號，最終實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)低豐度 miRNA 的精準(zhǔn)、靈敏成像。

冰凍三尺，非一日之寒，此次成果也得益于黃晉多年的積累。

2015 年，該團隊曾提出一種新型納米探針設(shè)計概念“FRET納米耀斑（FRET Nanoflare）”，相比傳統(tǒng)的單熒光染料標(biāo)記的納米探針，該探針能有效地避免系統(tǒng)波動和化學(xué)干擾產(chǎn)生的假陽性信號，提高了檢測的精準(zhǔn)度[2]。

但是，該 FRET 納米耀斑的設(shè)計仍然是基于“一對一”信號觸發(fā)模式，即一個靶標(biāo)只能觸發(fā)一個信號，對于細(xì)胞內(nèi)低豐度 miRNA 的檢測會面臨檢測靈敏度不足的問題。

因此，設(shè)計”一對多“信號觸發(fā)模式，即一個靶標(biāo)觸發(fā)多個信號，是黃晉接下來要極力實現(xiàn)的目標(biāo)。

脫氧核糖核酸酶（DNAzyme），是具有催化功能的單鏈寡核苷酸，它在特定金屬離子的輔助下能循環(huán)不斷地切割熒光標(biāo)記的基底鏈，產(chǎn)生”一對多“信號放大模式，因此被認(rèn)為是一種有效的信號放大策略。

2016-2017 年，黃晉和團隊設(shè)計了不同類型的基于 DNAzyme 的納米機器，其中包括適體酶（Aptazyme）、自切割核酶和裂開核酶，實現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)低豐度分子的靈敏檢測[3-5]。

2018 年，基于催化發(fā)夾組裝（CHA）技術(shù)，他們又構(gòu)建出一種發(fā)夾驅(qū)動的 DNA 納米機器，實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi) miRNA 的放大成像[6]。

但是，上述設(shè)計通常需要外加輔離子、或輔助分子來驅(qū)動納米機器的循環(huán)運行，這不僅會導(dǎo)致檢測過程復(fù)雜化，而且會改變原有的檢測體系，進而會降低納米機器的運行效率。

此后，該團隊嘗試?yán)眉?xì)胞內(nèi)源性高豐度 mRNA 作為燃料分子驅(qū)動納米機器的運行。通過大量的文獻調(diào)研和多次細(xì)致的討論，他們巧妙構(gòu)建了基于內(nèi)源性、高表達(dá)的 mRNA 分子作為驅(qū)動力設(shè)計的一種放大的 FRET 納米耀斑。

本質(zhì)上，F(xiàn)RET 納米耀斑是一種內(nèi)源性 mRNA 驅(qū)動的 DNA 納米機器，最終可實現(xiàn)”一對多“信號放大模式，其檢測靈敏度相比于”一對一“信號觸發(fā)模式提高了大約 3 個數(shù)量級[7]。

然而，該探針的初始活性是不可控的，探針在到達(dá)腫瘤位點之前，一旦遇到靶標(biāo)就會直接和它們相互作用，使探針被提早激活，產(chǎn)生非特異性信號，導(dǎo)致檢測精準(zhǔn)度低。

由于光可以在空間和時間上被精準(zhǔn)地操控，因此通常被作為一種有效地外界刺激物用于生物正交調(diào)節(jié)和精準(zhǔn)調(diào)控生物傳感器的活性。

基于此，黃晉采用光照作為外界刺激物實時控制探針的初始活性，使探針在運輸或者內(nèi)吞過程中一直處于失活的狀態(tài)。

進入細(xì)胞以后，通過光照在特定時間和特定地點被選擇性地激活。隨后，在低豐度 miRNA 的觸發(fā)下、以及高豐度 mRNA 的驅(qū)動下，探針即可自動地、程序性地在活細(xì)胞內(nèi)運行，不需要外加輔助物。

這不僅有效簡化了操作過程，還可提高納米機器的運行效率，進而提高了檢測精準(zhǔn)度和靈敏度。

探針進入腫瘤細(xì)胞以后，黃晉通過光照選擇地激活探針，隨后繼續(xù)與細(xì)胞進行孵育。

他和團隊發(fā)現(xiàn)，只有在光照和靶標(biāo)分子同時存在的條件下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)才能產(chǎn)生很強的 FRET 熒光信號。在沒有光照的情況下，即使有 miRNA 的存在，細(xì)胞內(nèi)也幾乎沒有明顯的 FRET 信號。

這說明該探針的初始活性是可控激活的，這種現(xiàn)象類似于“兩把鑰匙開一把鎖”，提高了檢測的準(zhǔn)確度和可信度。

除此之外，為驗證其信號放大效果，該團隊采用傳統(tǒng)的“一對一”信號觸發(fā)模式的納米耀斑作為對照，發(fā)現(xiàn)其FRET熒光信號明顯低于本次實驗設(shè)計的“一對多”信號觸發(fā)模式的納米耀斑，表明“一對多”信號放大模式的檢測靈敏度顯著提高。

類似地，他們將時空可控的、mRNA 驅(qū)動的納米機器用于動物實驗，發(fā)現(xiàn)只有在光照和腫瘤組織同時存在的情況下，才能在腫瘤部位產(chǎn)生顯著的 FRET 熒光信號。

因此，遠(yuǎn)程光激活的、放大的 FRET 納米耀斑能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤組織內(nèi) miRNA 的精準(zhǔn)、靈敏成像。

概括來說，此次研究理念為活細(xì)胞內(nèi)原位熒光成像低豐度靶標(biāo)提供了新的研究思路，避免了外加輔助物導(dǎo)致原有檢測體系破壞。

由于細(xì)胞內(nèi)含有大量的蛋白、核酸和小分子，這為他們設(shè)計內(nèi)源性分子驅(qū)動的 DNA 納米機器用于執(zhí)行活體內(nèi)特定的任務(wù)提供了前提條件。

黃晉說，研究中最讓人難忘的事，當(dāng)屬該團隊每周的組會討論。在討論過程中，總會有新的問題不斷地被提出、隨后通過各種途徑不斷地尋求解決辦法。

問題解決時，那種“柳暗花明、茅塞頓開“的喜悅之情，以及在項目執(zhí)行過程中大家孜孜不倦的探索精神，都變成了最美好、難忘的時光。

雖然內(nèi)源性驅(qū)動的概念早有報道，例如小分子 ATP，但是 ATP 與其核酸適配體（aptamer）的相互作用力有限。

如何發(fā)展新的內(nèi)源性驅(qū)動力設(shè)計“一對多”信號放大模式，是過去一段時間來團隊內(nèi)部經(jīng)常討論的話題。

在實驗以及投稿過程中，他們經(jīng)歷了一次次失敗，一次次重復(fù)，沮喪過也迷茫過。

該團隊表示：“依然記得在文章來意見后補實驗的過程中，經(jīng)常因為要做共聚焦實驗和電泳實驗熬夜到很晚，一天實驗之后，大家還要一起繼續(xù)討論實驗結(jié)果并制定第二天的實驗方案，每個人都樂此不疲。”

對于未來黃晉表示，精準(zhǔn)、靈敏可視化定量細(xì)胞內(nèi)低豐度分子，對于基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)，都具有重要研究價值和應(yīng)用潛力。

因此在后續(xù)研究計劃中，一方面可以結(jié)合腫瘤治療****物，實現(xiàn)診療一體化設(shè)計。另一方面，目前可利用的內(nèi)源性驅(qū)動分子的種類和含量具有一定的局限性，在一定程度上限制了其廣泛的應(yīng)用。

因此，有必要探究新的可利用的內(nèi)源性物質(zhì)，例如：內(nèi)源性離子、小分子和蛋白質(zhì)等，從而構(gòu)建出內(nèi)源性驅(qū)動的 DNA 納米機器執(zhí)行各種新的任務(wù)。

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參考: 
1. Photocaged amplified FRET nanoflares: spatiotemporal controllable of mRNA-powered nanomachines for precise and sensitive microRNA imaging in live cells. Nucleic Acids Res.
2. FRET Nanoflares for Intracellular mRNA Detection: Avoiding False Positive Signals and Minimizing Effects of System Fluctuations. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 8340-8343.
3. Aptazyme?Gold Nanoparticle Sensor for Amplified Molecular Probing in Living Cells.Anal. Chem. 2016, 88, 5981-5987.
4. Gold Nanoparticle Based Hairpin-Locked-DNAzyme Probe for Amplified miRNA Imaging in Living Cells. Anal. Chem. 2017, 89, 5850?5856. 
5. Gold Nanoparticle Loaded Split-DNAzyme Probe for Amplified miRNA Detection in Living Cells. Anal. Chem. 2017, 89, 8377?8383
6. Hairpin-fuelled catalytic nanobeacons for amplified microRNA imaging in live cells.Chem. Commun., 2018, 54, 10336-10339.
7. Amplified FRET Nanoflares: An Endogenous mRNA-Powered Nanomachine for Intracellular MicroRNA Imaging. Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 20104 -20111