可編輯堿基對長度從幾十擴至數(shù)千，「先導編輯」系統(tǒng)讓治療復雜遺傳病成為可能？業(yè)內人士：遞送挑戰(zhàn)仍存，長期安全性有待觀察

在剛剛結束的 2021 年，基因編輯領域交出了令人較為欣喜的成績單。

6 月，諾獎得主 Jennifer Doudna 創(chuàng)辦的公司 Intellia 和再生元共同發(fā)布一項 CRISPR 候選****物臨床 I 期試驗中期數(shù)據，結果表明該****物實現(xiàn)了對患者肝臟內細胞的基因編輯，且安全性良好。這一試驗結果以題為“CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis”的文章發(fā)表在國際頂尖醫(yī)學期刊 The New England Journal of Medicine (NEJM) 上，為全球范圍內首個公開報告的體內 CRISPR 基因編輯療法臨床試驗結果，并被 Science 納入當年 “年度十大科學突破”。

12 月，基因編輯領域知名科學家劉如謙（David R. Liu）團隊在 Nature Biotechnology 上發(fā)表論文表示，其對基因編輯系統(tǒng) “先導編輯”（Prime Editor，以下簡稱 PE）進行了更新，新版本的 PE（PE3.0）在人類細胞中可編輯的基因長度擴展至數(shù)千對堿基（長度相當于一條完整的基因），而上一版本系統(tǒng)中這一數(shù)字為數(shù)十。這一突破被認為是基因編輯治療向更安全、更精準邁出的重要一步。

“實現(xiàn)大片段堿基對的修復，有助于擴寬基因編輯技術治療疾病的范圍?！?nbsp;瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學院副教授鄭宗立對生輝如此表示。

其實，回顧 20 世紀末至今，基因編輯領域共出現(xiàn)三大主流技術，從 ZFN、TALENs，再到如今被廣泛使用的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高，應用范圍逐漸擴大，為基因功能研究提供有力工具的同時，也讓傳統(tǒng)手段無法醫(yī)治的復雜疾病看到可被治療的希望。

從工作機制上看，ZFNs、TALENs 和 CRISPR/Cas 都是在基因組靶標位點引起 DNA 雙鏈斷裂，進而激活細胞自我修復機制，完成基因的編輯。只是，與 ZFN 和 TALEN 技術需靶向 DNA 序列中特異性蛋白誘發(fā) DNA 雙鏈的斷裂不同，CRISPR/Cas 系統(tǒng)則避免了這一繁瑣的步驟，通過利用一段特定序列的向導 RNA 分子（guide RNA，gRNA）將核酸內切酶引至靶點，更高效地完成基因編輯，這也是 CRISPR/Cas 技術得以廣泛應用的原因。

這三種基因編輯方法下，可有效改變基因的表達，但缺少對基因編輯結果的掌控：DNA 雙鏈斷裂后的自我修復過程中，較易引起隨機插入、缺失的異源末端連接以及需要同源模板才可激活同源重組修復的情況，存在一定的不確定性。

面對這一問題，科學家在不斷探索新的方案。2016 年，David Liu 團隊在 Nature 發(fā)表論文表示，他們開發(fā)了 CRISPR-Cas9 單堿基編輯器，可在不導致 DNA 雙鏈斷裂的情況下實現(xiàn)對基因組點突變的定向修改；2019 年，David Liu 團隊公布其基于 CRISPR-Cas9 開發(fā)的無需 DNA 雙鏈斷裂的基因編輯系統(tǒng) ——Prime Editor（“先導編輯” 系統(tǒng)），相關論文發(fā)表在 Nature 上。

可以說，CRISPR/Cas 打開了高效基因編輯的新局面，而在此基礎上實現(xiàn)的 Prime Editor 實現(xiàn)了更精準的基因編輯。

如上述提到的 David Liu 團隊 2019 年所發(fā)文章標題所示，Prime Editor 是一款遵循 “查找 - 替換”（search-and-replace）邏輯運行的基因編輯系統(tǒng)。

為實現(xiàn)如文字編輯器中方便快捷的 “查找 - 替換” 工具效果，他們率先對 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)兩大組成部分 ——Cas9 酶和 gRNA 進行了 “替換”：一方面將向導 RNA 分子進行改造，在其 3' 端添加一段 RNA 序列，即引物結合序列（Primer binding site，PBS）和轉錄模版序列（RT template），形成能夠結合特定目標基因且自帶基因編輯模板的 RNA 分子，被稱作基于改造的向導 RNA（the engineered guide RNA ，the pegRNA）；另一方面，用 Cas9 切口酶（Cas9 nickase）和逆轉錄酶融合而成的蛋白復合體替換 Cas9 酶

該 PE 系統(tǒng)之下，Cas9 切口酶可在 pegRNA 指引下定位到目標位置，對 DNA 單鏈進行切割。之后 pegRNA 3′端的引物結合序列與切斷前的互補序列識別配對，逆轉錄酶以 pegRNA 上與引物結合序列形成后的序列為模板進行逆轉錄，將目標序列聚合至切斷的 DNA 鏈上。接下來，細胞將通過自身的 DNA 修復機制把新的 DNA 序列整合到基因組。

這樣，在 pegRNA 的 “限制” 下，該系統(tǒng)可有效減少脫靶效應，在切斷 DNA 單鏈的情況下，實現(xiàn)對堿基的精準轉換、插入和缺失等，最多可插入 44bp，或刪除 80bp，若超過 100bp 的 DNA 片段，系統(tǒng)編輯效率將會降低。這一研究論文中提到，理論上，PE 系統(tǒng)可對人類 89% 遺傳疾病相關的基因變異進行糾正。

但應用于實際研究或治療人類遺傳疾病，需要編輯的 DNA 片段要更長。為擴大基因編輯技術研究和治療疾病的范圍，在那之后，David Liu 團隊對 PE 系統(tǒng)進行了兩次升級。

他們發(fā)現(xiàn)，PE 系統(tǒng)中使用的 pegRNA3' 端降解導致系統(tǒng)活性降低，為基因編輯效率較低的一大原因。對此，David Liu 團隊開發(fā)了工程化的 pegRNA，將 PE 系統(tǒng)基因編輯效率提升 3-4 倍。這一研究進展于 2021 年 10 月發(fā)表在 Nature Biotechnology 上。

12 月，David Liu 團隊 PE 系統(tǒng)的升級版 “twinPE” 在 Nature Biotechnology 上發(fā)布，使用 twinPE 系統(tǒng)，可插入、替換或刪除的序列長度約為 800bp。在 twinPE 系統(tǒng)中，David Liu 團隊將 pegRNA 增加至兩條，進行基因編輯過程中，這兩條 pegRNA 將在特定位置分別對 DNA 鏈進行切割。同樣是 DNA 雙鏈斷裂，不同的是，twinPE 選擇在不同位置對 DNA 雙鏈進行切割，確保 DNA 雙鏈不完全斷裂，實現(xiàn)基因編輯結果的可控性。

此次研究中，他們在人體細胞中對引起罕見遺傳病亨特綜合征（Hunter syndrome）的相關基因進行了編輯，該疾病由長度為 4000bp 的 DNA 片段導位引起。研究人員使用 twinPE 將數(shù)千堿基對大小的 DNA 片段精確插入到基因組的異常位點。

這表明，twinPE 系統(tǒng)具備應用于大型基因突變所致遺傳疾病治療的潛力。

然而，對于基因治療領域繞不開的遞送問題，PE 系統(tǒng)自然也不例外。而且，“ Priem Editor 帶有的逆轉錄酶比較大，更增加了遞送難度。”

除此之外，“基因治療面臨的挑戰(zhàn)還包括精確的編輯（PE仍可產生Indel副產物）、未知的人體系統(tǒng)免疫反應以及脫靶等長期安全性問題”。鄭宗立說道，該系統(tǒng)引入的逆轉錄酶對于人體屬于“外來物”，它是否會對細胞及人體產生潛在的影響，還需要長期的觀察。
過去兩年，全球體內基因編輯療法開始進入臨床，首例人體試驗數(shù)據也在去年公布。而對于基因編輯技術更大規(guī)模地應用于臨床，鄭宗立表示，長期安全性、有效性問題仍是最大的挑戰(zhàn)。
參考資料：

• https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
• https://www.science.org/content/article/breakthrough-2021#section_breakthrough
• https://www.nature.com/articles/s41587-021-01133-w
• https://www.broadinstitute.org/news/new-prime-editing-system-inserts-entire-genes-human-cells
• https://www.broadinstitute.org/news/new-crispr-genome-editing-system-offers-wide-range-versatility-human-cells
• https://mp.weixin.qq.com/s/9A6Vsxgz0IXaJ7e3L68Cmw
• https://baike.baidu.com/tashuo/browse/content?id=a800080106745dd97170f31f