離心技術(shù)的應用

離心技術(shù)的應用

離心技術(shù)（centrifugal technique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項技術(shù)應用很廣，諸如分離出化學反應后的沉淀物，天然的生物大分子、無機物、有機物，在生物化學以及其它的生物學領域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質(zhì)。

　　一、基本原理的分類

　　（一）基本原理

　　⒈離心力（centrifugal force，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

　　其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。

　　⒉相對離心力（relative centrifugal force，RCF）由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。

　　RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

　　式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。

　　在上式的基礎上，Dole和Cotzias制作了與轉(zhuǎn)子速度和半徑相對應的離心力的轉(zhuǎn)換列線圖，見圖16-4，在用圖16-4將離心機轉(zhuǎn)數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標尺上取已知的離心機轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點，即為相應的離心力數(shù)值。例已知離心機轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標尺，此交點500×g即是RCF值。

　?、吵两迪禂?shù)（sedimentation coefficient，s）根據(jù)1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。

　　若ω用2πn/60表示，則

　　式中X₁為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S實際上時常在10^-13秒左右，故把沉降系數(shù)10^-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。

　?、闯两邓俣龋╯edimentation velocity）沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內(nèi)物質(zhì)運動的距離。

　　式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質(zhì)的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質(zhì)的密度。

　　從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：

　　從該式中可看出，①當ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。

　?、党两禃r間（sedimentation time，Ts）在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。

　　根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

圖16-4　離心力的轉(zhuǎn)換列線圖

　　將左側(cè)r點與右側(cè)n點連成一條直線，與中間RCF相交的

　　點即為相對離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

　　積分得

　　式中X₂為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心管底內(nèi)壁的距離；X₁為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子完全沉降到底管內(nèi)壁的時間（t₂－t₁）用Ts表示則式可改為：

　　式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。

　?、禟系數(shù)（k factor） K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

　　其中R_max為轉(zhuǎn)子最大半徑；R_min為轉(zhuǎn)子最小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當轉(zhuǎn)速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變了。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預計沉降到管底所需的離心時間是T＝k/S＝4h，利用此公式預估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預估的時間來得快些。

　　（二）分類

　　根據(jù)離心原理，按照實際工作的需要，目前已設計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

　?、逼胶怆x心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法（differential velocity centrifugation）和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation）。

　　⒉等密度離心法（jsopycnic centrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。

　?、辰?jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化等。

　　二、離心分離方法

　?。ㄒ唬┎钏匐x心法

　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。

　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

　　例如用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

　?。ǘ┧俾蕝^(qū)帶離心法

　　速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂