高效液相色譜儀操作三要點(diǎn)

　　一、脫氣

　　流動相脫氣對于避免HPLC系統(tǒng)出問題，順利得到一個理想的數(shù)據(jù)是一個很有效的措施。HPLC系統(tǒng)內(nèi)是不希望有氣泡存在的。HPLC泵在輸送液體時要產(chǎn)生很大的力量，由于氣體的壓縮比與液體相比大的多，因而當(dāng)氣泡存在時，你將觀察到瞬間的流速降低和系統(tǒng)壓力下降。如果這個氣泡足夠大，液相泵將不能輸送任何溶劑，而且如果壓力低于預(yù)先設(shè)定的壓力低限，泵將停止工作。有些泵設(shè)計(jì)可以很好地排除氣泡，而也有一些泵設(shè)計(jì)當(dāng)氣泡存在時將停止運(yùn)轉(zhuǎn)。

　　當(dāng)一個氣泡通過輸液泵時，由于系統(tǒng)壓力大，氣泡通常會溶解在流動相溶液中，隨流動相通過柱子。但是到達(dá)檢測器流通池時系統(tǒng)壓力又恢復(fù)到了大氣壓，因而氣泡可能在檢測器流通池中又顯現(xiàn)，在色譜圖上會出現(xiàn)不規(guī)律的毛刺。為解決這個問題，有些儀器公司設(shè)計(jì)一個反壓控制器，這樣可以在檢測器出口提供足夠的壓力保持氣泡始終溶解在流動相中直到它們流出檢測器。當(dāng)然，這個壓力不能超過流通池所能承受的壓力極限，否則可能損壞檢測器。

　　紫外/可見光（UV/VIS）檢測器的液相色譜圖中的噪音毛刺通常是氣泡進(jìn)入并通過流通池的征兆。有些檢測器對空氣的存在也非常敏感，但表現(xiàn)出的征兆與UV/VIS不同，例如有報導(dǎo)說，當(dāng)使用熒光（FL）檢測器時，流動相中溶解氧的存在可能會使一些化合物失去熒光性。此外，對于利用待測物質(zhì)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)引起電流變化而進(jìn)行檢測的電化學(xué)（EC）檢測器，對流動相中的溶解氧的存在也非常靈敏。此外，氣泡的存在有時還會導(dǎo)致保留時間不重現(xiàn)。

　　所以，必須注意消除流動相中的空氣，并且還應(yīng)避免空氣由管路（如PTFE管）滲透進(jìn)流動相中。

　　如果適當(dāng)?shù)仃P(guān)注在使用之前脫去流動相中溶解進(jìn)的空氣，上述這些問題均能避免，或把影響降至最低。常用的脫氣方法有如下幾種：

　　1. 吹氦脫氣法。利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60 mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個高效分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但我們國內(nèi)氦氣價格較高，很少有實(shí)驗(yàn)室采用此方法。

　　2. 加熱回流法。此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。

　　3. 抽真空脫氣法。此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。

　　4. 超聲波脫氣法。將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果最差。

　　5. 在線脫氣法?，F(xiàn)在商品的HPLC儀器，均可配在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。建議購買儀器時一定要購買，有的公司是作為選購件，所以與儀器公司談配置時應(yīng)與公司確認(rèn)。

　　二、過濾

　　任何顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)后都會在柱子入口端被篩板擋住，最后的結(jié)果是將柱子堵塞，表現(xiàn)出的特征是系統(tǒng)壓力增加并使色譜峰變形。因此，要采取各種預(yù)防措施，包括操作步驟和商品儀器自身的各種過濾設(shè)計(jì)，努力防止或減少顆粒物進(jìn)入HPLC系統(tǒng)中，從而延長儀器和色譜柱的使用壽命，并提高數(shù)據(jù)的可靠性。在HPLC系統(tǒng)中，顆粒物的主要來源有三個途徑：流動相、被測樣品和儀器系統(tǒng)部件的磨損物。

　　1、流動相

　　如果流動相均由高效液相色譜級溶劑組成，流動相沒有必要過濾。這是因?yàn)楦咝б合嗌V級的有機(jī)溶劑，例如乙腈、甲醇等，在制造的工藝過程中都已經(jīng)過了0.2 μm微孔濾膜過濾。同樣的，無論你是買的HPLC級的水還是在實(shí)驗(yàn)室使用超純水凈化系統(tǒng)制備的水，最后一步也是通過0.2 μm微孔濾膜。然而，如果有任何一種緩沖液中加入了固體物，例如磷酸鹽，流動相過濾將是必要的一個步驟。雖然緩沖鹽可能是可溶解的、高純的，但它還是可能含有顆粒物質(zhì)，例如在蓋試劑瓶的塑料內(nèi)蓋時，塑料瓶蓋子與瓶口邊緣擠壓就會產(chǎn)生塑料顆粒。在這種情況下，添加的一種固體物可能完全溶解了，但是少量雜質(zhì)顆粒存在于流動相中成為殘?jiān)?/P>

　　流動相通過0.45 μm微孔濾膜過濾對于從流動相中除去所有顆粒物是一個有效方法。0.2 μm微孔濾膜也可以用，但是它們就這個應(yīng)用而言并不比0.45μm微孔濾膜更有效，而且它的過濾速度會更慢，特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室使用的試劑和水的質(zhì)量不太好時。建議實(shí)驗(yàn)室在編寫制定他們流動相制備標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOPs）時規(guī)定，可以借鑒國際上同類實(shí)驗(yàn)室的規(guī)定，即：

　　流動相制備僅采用HPLC級液體時不需要過濾，反之所有流動相組成在使用前必須過濾。

　　在連接儲液瓶和泵的輸液管的末端入口采用下沉式過濾器（常見材質(zhì)有熔融玻璃砂芯濾板和微孔金屬的兩種）也是很重要的。這個過濾器的規(guī)格為≥10 μm的微孔物質(zhì)，所以它不能取代流動相過濾步驟，但是它能除去系統(tǒng)中的塵土并保證儲液瓶、輸液管使用的可靠性。