免疫熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法及其分類

　　二、熒光抗體染色方法及其分類

　　1.直接染色法

　　將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見(jiàn)到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，操作簡(jiǎn)便，比較快速。缺點(diǎn)是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，抑制試驗(yàn)對(duì)照。

　　2.間接染色法

　　如果檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，作用一定時(shí)間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標(biāo)記的抗體起著雙重作用，對(duì)抗原來(lái)說(shuō)起抗體的作用，對(duì)第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標(biāo)本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

　　由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標(biāo)記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動(dòng)物血清球蛋白免疫其他動(dòng)物來(lái)制備。

　　間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點(diǎn)是：由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時(shí)較難，操作繁瑣，對(duì)照較多，時(shí)間長(zhǎng)。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，還應(yīng)設(shè)有中間層對(duì)照（即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清）。

　　3.抗補(bǔ)體染色法

　　抗補(bǔ)體染色法簡(jiǎn)稱補(bǔ)體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，水洗，然后再加標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物，則補(bǔ)體便被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體便與補(bǔ)體發(fā)生特異性反應(yīng)，使之形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光。

　　抗補(bǔ)體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，還有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：即只需要一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，便能檢測(cè)各種抗原-抗體系統(tǒng)。因?yàn)檠a(bǔ)體的作用沒(méi)有特異性，它可以與任何哺乳動(dòng)物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。它的缺點(diǎn)是參與反應(yīng)的成分多，染色程序較復(fù)雜，比較麻煩。

　　除上述三種方法外，還有在此基礎(chǔ)上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補(bǔ)體法等等。