如何確定光譜信號(hào)就是所標(biāo)記探針的信號(hào)

　　1.自發(fā)熒光的可變性。a在不同激發(fā)光條件下，自發(fā)熒光會(huì)有明顯不同；b動(dòng)物身體的不同部位會(huì)有不同的自發(fā)熒光；c同一只動(dòng)物在不同時(shí)間自發(fā)熒光的波譜和強(qiáng)度也可以不同；d不同小鼠的自發(fā)熒光在波譜和強(qiáng)度上也有差別；e有時(shí)會(huì)受到飼料的影響。

　　2.所用探針的發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)。用于基因和細(xì)胞水平熒光探針或熒光蛋白發(fā)射波長(zhǎng)通常在600nm以下，而活體研究最佳的發(fā)射波長(zhǎng)范圍在600-900nm之間。

　　3.受探針濃度的影響。熒光探針通常通過尾靜脈打入體內(nèi)，探針會(huì)被動(dòng)物的血液和組織稀釋，如果沒有明顯的靶向，在活體內(nèi)信號(hào)會(huì)比較弱，因此探針的靶向性一定要明確，如果沒有靶向性，在活體條件下尋找探針的特征光譜會(huì)非常難。

　　4.受位置的影響。如果探針靶向的部位距體表較遠(yuǎn)，一方面激發(fā)光的射入會(huì)減少，同時(shí)發(fā)射光也會(huì)被組織吸收，位置越深，減少越多。因此如果靶向的部位較深，一定要保證探針的濃度使發(fā)光足夠強(qiáng)，同時(shí)盡量選用發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的探針。

　　5.合成的探針在活體條件下容易發(fā)生變化。用化學(xué)或生物的方法合成探針通常在較純的溶劑中發(fā)生反應(yīng)，但是活體條件下，動(dòng)物的血液、組織液成分復(fù)雜，親水或疏水性質(zhì)難以預(yù)測(cè)，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)大量存在，在體外表現(xiàn)很好的探針也有可能在體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的變化，導(dǎo)致探針發(fā)生結(jié)構(gòu)改變或脫落，從而發(fā)射波譜也會(huì)發(fā)生未知的改變。

　　活體熒光成像面臨著多方面的挑戰(zhàn)，如何才能做到準(zhǔn)確無(wú)誤的尋找到所要的波譜，進(jìn)而進(jìn)行合適的光譜分離呢？以下是一些做體內(nèi)熒光成像的一些建議：

　　1.探針體外表現(xiàn)穩(wěn)定可靠。探針合成之后必須要在打入體內(nèi)之前進(jìn)行成像，確定發(fā)射波譜和強(qiáng)度，需要考察不同批次探針之間是否存在差異，是否有淬滅現(xiàn)象，如果可能的話，用血液等生物體液溶解探針觀察是否存在變化。另外在體外觀察探針時(shí)，也一定要用溶劑做對(duì)照。

　　2.要確定靶向性。也就是說要有陽(yáng)性對(duì)照，比如說要做腫瘤的早期診斷，盡量參考前人研究先用確定能夠靶向的分子作為陽(yáng)性對(duì)照，這樣打入體內(nèi)后，確定能夠在腫瘤位置找到探針的波譜，如此確定之后，找到適合體內(nèi)光譜分離的拆分條件，用于之后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

　　3.活體成像時(shí)一定要有對(duì)照。也就是說有陰性對(duì)照組，比如通過陽(yáng)性對(duì)照組確定波譜之后，以此光譜分離的拆分條件對(duì)陰性對(duì)照組進(jìn)行拆分，如果條件合適的話，陰性對(duì)照組應(yīng)該是沒有相應(yīng)信號(hào)的。如此，再比較拆分條件中探針的發(fā)射波長(zhǎng)和體外觀察時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)，如果兩者比較接近，那么就能夠肯定所尋找的探針波譜就是所考察的信號(hào)。

　　4.通過已有知識(shí)和時(shí)間變化來確定。如果已知所考察探針是親肝的或親腎的，在活體內(nèi)在肝或腎的部位出現(xiàn)信號(hào)的聚集，那么此處的信號(hào)可能會(huì)是所考察探針的信號(hào)，另外根據(jù)信號(hào)隨時(shí)間的變化來確定是不是所要的信號(hào)，比如腫瘤部位的某種信號(hào)在注射探針后有明顯的隨時(shí)間的上升后下降的過程，這種現(xiàn)象也提示這個(gè)信號(hào)就是所考察探針的信號(hào)。

　　5.實(shí)驗(yàn)初期，盡量選用較高濃度或發(fā)光強(qiáng)度的探針。新合成的探針一般會(huì)首先觀察它的靶向性和體內(nèi)代謝情況，這時(shí)盡量選用最大的劑量或濃度，在動(dòng)物生命體征不受影響的情況下，越多含量的探針對(duì)于體內(nèi)觀察越有利。在對(duì)考察探針體內(nèi)靶向及代謝情況比較了解之后再考慮減少含量，達(dá)到最優(yōu)的生物學(xué)效果。

　　通過以上建議，可以歸納為如下流程圖：