一招變身檢測熒光達(dá)人
檢測熒光方法和手段根據(jù)不同的實驗要求和目的也多種多樣,使用最多的還是熒光顯微鏡,熒光酶標(biāo)儀,流式細(xì)胞儀等。但是,無論何種儀器,無論儀器的性能如何,要得到準(zhǔn)確的實驗結(jié)果,準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù),最基本的條件就是根據(jù)所使用的熒光染料正確設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長。
下面我們以熒光顯微鏡的熒光濾色鏡為例,介紹一下濾色鏡組的構(gòu)造以及根據(jù)染料,如何正確選擇濾色片。
熒光激發(fā)塊是熒光顯微鏡中用來激發(fā)熒光標(biāo)本和觀察熒光的核心部件,它實際是濾色片的組合,一般含有3種濾色片:
1. 激發(fā)濾色片(Exciter Filter):選擇透過某個波段的光,來激發(fā)熒光染料。
2. 分色鏡 (Dichroic Mirror):反射激發(fā)光,透過熒光,一般激發(fā)光波長短,而發(fā)射光波長較長。
3. 發(fā)射濾色片(Barrier Filter) :透過發(fā)射光,也就是我們看到的“熒光”。同時阻擋各種雜散光和激發(fā)光的反射光。
根據(jù)熒光觀察的原理——熒光染料吸收特定波長的光(即激發(fā)光),躍遷到激發(fā)態(tài),然后再釋放出特定波長的發(fā)射光(即熒光),回到基態(tài)。由此可知熒光染料所需的激發(fā)光和釋放的熒光都是特定波長的,所以需要利用各種濾色片來選擇性的透過某種特定波長的光來實現(xiàn)熒光觀察。否則,就會出現(xiàn)激發(fā)不了,激發(fā)了卻看不到或串色的現(xiàn)象。所以選擇合適的濾色片非常重要!
下面我們以熒光染料DAPI為例,闡述該如何選擇熒光激發(fā)塊。
通過上圖,我們可以了解到DAPI的激發(fā)光波長為300nm-410nm左右,激發(fā)峰值在360nm左右,也就是說激發(fā)光在300-410nm時可以激發(fā)DAPI染料,在360nm時激發(fā)效率最高。發(fā)射光波長為390nm-600nm,峰值在470nm左右。接著,我們就根據(jù)這些數(shù)據(jù)來選擇濾色片。
上圖為Olympus U-FUW激發(fā)塊的光譜信息。我們可以了解到此激發(fā)塊可以提供的激發(fā)光波長在300-400nm之間,剛好可以激發(fā)DAPI。允許透過的熒光光譜范圍也在410nm以上,所以此激發(fā)塊可以用來實現(xiàn)DAPI熒光染料的觀察。
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