半年「吸金」超6億美元，火熱的環(huán)狀RNA如何激活新產(chǎn)業(yè)？基因治療和新****開發(fā)將是其最具價值的方向

2020 年，Moderna 和 BioNTech 開發(fā)的 mRNA 疫苗在不到一年的時間內(nèi)相繼獲 FDA 批準(zhǔn)有條件上市，這讓底層技術(shù) mRNA 技術(shù)備受關(guān)注，并在全球范圍掀起一股創(chuàng)新技術(shù)熱潮。

2021 年 2 月，全球首家 “環(huán)狀 RNA” 初創(chuàng) Orna Therapeutics 獲 8000 萬美元融資并正式走出隱匿模式，這也預(yù)示著 “mRNA2.0” 時代的來臨。理論上，與線性 RNA 相比，這種環(huán)狀 RNA——oRNA 呈封閉環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，不易降解，可更高效穩(wěn)定地表達(dá)蛋白質(zhì)。

與此同時，越來越多的 mRNA（自擴(kuò)增 / 非復(fù)制）技術(shù)、環(huán)狀 RNA 等初創(chuàng)如雨后春筍般涌現(xiàn)，不斷推陳出新，斬獲大額融資。

2021 年 5 月，環(huán)狀 RNA 公司 Laronde 帶著 4000 萬美元正式出道，時隔 3 個月后，該公司再次斬獲 4.4 億美元融資。無獨(dú)有偶，Laronde 與 Moderna 同為 “資本的寵兒”，還師出同門，均由美國知名風(fēng)險機(jī)構(gòu) Flagship Pioneering（以下簡稱 “FP”）孵化。

該公司把其正在研究的環(huán)狀 RNA 稱之為 Endless RNA?（eRNA），并宣稱 eRNA 具有持久性、非免疫原性、允許重復(fù)給****、靈活的配制和遞送方式等優(yōu)勢。理論上，這種 RNA 能夠在體內(nèi)長期存在，并表達(dá)用于治療疾病的蛋白質(zhì)。

今年 6 月，國內(nèi)環(huán)狀 RNA 公司環(huán)碼生物正式成立并斬獲千萬美元天使輪融資；國內(nèi)環(huán)狀 RNA  產(chǎn)研服務(wù)商吉賽生物也在從服務(wù)轉(zhuǎn)向基于具有重大功能的環(huán)狀 RNA 翻譯產(chǎn)物開發(fā)疾病治療靶點(diǎn)。
與線性 mRNA 相比，環(huán)狀 RNA 的優(yōu)勢是什么？整體研發(fā)現(xiàn)狀如何？真正釋放產(chǎn)業(yè)化潛力還有哪些難題有待解決？

1976 年，德國科學(xué)家 Heinzl. Sanger 等人在 PANS 發(fā)表文章，證實(shí)了類病毒（Viroids）是一種單鏈共價閉合環(huán)狀 RNA 分子，這是人類首次發(fā)現(xiàn)環(huán)狀 RNA 分子的存在。但在當(dāng)時的背景下，科學(xué)家們只將其看作一種冗余的錯誤剪接產(chǎn)物。
2012 年，斯坦福大學(xué)的生物醫(yī)學(xué)和生物化學(xué)副教授 Julia Salzman 發(fā)現(xiàn)人體中大量存在一類環(huán)狀 RNA 暗物質(zhì)，被譽(yù)為 "改寫教科書的重****現(xiàn)"。
2013 年，Nature 報(bào)道了兩篇文章，首次在功能上表征天然環(huán)狀 RNA 分子；2014 年，在擬南芥中也確認(rèn)了 circRNA 的存在，由此拉開植物 circRNA 的研究序幕。自此，大量科學(xué)家開始涌入這個領(lǐng)域。
同一時期，在國外，美國 RNA 技術(shù)開發(fā)公司 Arraystar 推出全球首款商業(yè)化的環(huán)狀 RNA 芯片；在國內(nèi)，中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組研究了小鼠骨髓細(xì)胞中分離的長期造血干細(xì)胞和多能干細(xì)胞的環(huán)狀 RNA 的表達(dá)譜，曹雪濤院士課題組研究了環(huán)狀 RNA 在肝癌中發(fā)揮的功能。

大多數(shù)真核基因以內(nèi)含子和外顯子間隔排列，轉(zhuǎn)錄本通常需要通過可變剪接去掉內(nèi)含子，這種機(jī)制可以從特定的基因中產(chǎn)生多種 mRNA 分子。在人類基因組中，95 % 以上的基因是具有可變剪接的，它們通常由順式調(diào)節(jié)元件和反式作用因子共同調(diào)控。這其中，除了產(chǎn)生各種線性 mRNA 之外，許多真核基因也產(chǎn)生出具有末端共價連接的環(huán)狀 RNA。即下游剪接位點(diǎn)與上游剪接位點(diǎn)連接形成的閉合環(huán)狀分子。
其次，外顯子跳讀所形成的套索驅(qū)動環(huán)化也是環(huán)狀 RNA 生成的一種機(jī)制；此外，剪接過程中從分支結(jié)構(gòu)脫離的內(nèi)含子索套也會產(chǎn)生環(huán)狀 RNA。

長期以來，環(huán)狀 RNA 一直被認(rèn)為是 mRNA 剪切過程中的副產(chǎn)物，沒有特定的功能。但近年來，人們在真菌、原生生物、植物、果蠅、小鼠以及人類細(xì)胞中相繼發(fā)現(xiàn)很多環(huán)狀 RNA。越來越多的研究表明，環(huán)狀 RNA 并非 mRNA 剪切的副產(chǎn)物，而是在細(xì)胞中發(fā)揮重要作用的一類 RNA 分子。
這種 RNA 相當(dāng)于線性 RNA 分子中的 3’ 和 5’ 端被連接形成了閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，失去了 PolyA 尾巴，因此對核酸外切酶不敏感，也可以更加穩(wěn)定地存在。
香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系助理教授史家海表示，“環(huán)狀 RNA 的優(yōu)勢主要在于可以防止降解，提高 RNA 的表達(dá)時間和表達(dá)量，因?yàn)?RNA 的降解是從尾端開始，環(huán)化后就沒有酶切的尾端了，只有 RNA 核酸內(nèi)切酶才能切，所以環(huán)狀 RNA 比線性 RNA 在血漿中的表達(dá)時間更長，預(yù)計(jì)在細(xì)胞中也是更長。” 史家海在 3 年前就開始了環(huán)狀 RNA 的相關(guān)研究。
在 FP 推出環(huán)狀 RNA 公司 Laronde 之際，其首席執(zhí)行官 Diego Miralles 就曾表示，除了可以在體內(nèi)長效穩(wěn)定表達(dá)之外，環(huán)狀 RNA ****物還可以重復(fù)給****，并且可以通過多種途徑向患者給****，包括皮下、靜脈、肌內(nèi)和外用的方式。

與線性 mRNA 相比，環(huán)狀 RNA 是閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不能利用真核細(xì)胞的翻譯機(jī)制，需要依賴一些翻譯啟動元件的參與啟動翻譯。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀 RNA 的翻譯方式主要有核糖體介入位點(diǎn) (internal ribosome entry site，IRES) 介導(dǎo)的翻譯、滾環(huán)擴(kuò)增翻譯、由 UTR (untranslated region) 翻譯激活元件介導(dǎo)的翻譯和 m6 A 修飾介導(dǎo)的翻譯 。
"目前主流的是 IRES，因?yàn)檫@個元件能夠被核糖體識別，比較獨(dú)特，很多做環(huán)狀 RNA 的公司都會選擇這種方式"，吉賽生物的 CEO 劉明告訴生輝，" 滾環(huán)翻譯的方式能夠讓環(huán)狀 RNA 翻譯產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)，也可以利用有限的核苷酸序列翻譯出更大的蛋白質(zhì)，這是 mRNA 無法做到的事情，在產(chǎn)業(yè)化上更有想象空間。" 吉賽生物是在環(huán)狀 RNA 賽道蟄伏 7 年的產(chǎn)研服務(wù)商，正在布局產(chǎn)業(yè)化賽道。
上海環(huán)碼基因的聯(lián)合創(chuàng)始人王澤峰也在接受媒體采訪時表示，只要 mRNA 可以干的事情，環(huán)狀 RNA 都可以干，但是環(huán)狀 RNA 又能干一些 mRNA 干不了的事情。
Laronde 的首席執(zhí)行官 Diego Miralles 就表示，其環(huán)狀 RNA 平臺能夠在體內(nèi)表達(dá)任何治療性蛋白質(zhì)，包括肽、凝血因子等，任何類型的治療性抗體，包括跨膜蛋白、疫苗等，甚至是生物學(xué)上從未做過的事情，例如細(xì)胞內(nèi)抗體或離子通道。并且宣稱團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明其環(huán)狀 RNA 可以在動物體內(nèi)獲得穩(wěn)定、持久的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

自 1976 年發(fā)現(xiàn)環(huán)狀 RNA 分子以來，學(xué)術(shù)界開啟了對環(huán)狀 RNA 的漫漫探索之旅。2013 年，學(xué)術(shù)界在環(huán)狀 RNA 領(lǐng)域取得重大進(jìn)展，越來越多的科學(xué)家們進(jìn)入了該領(lǐng)域。
基礎(chǔ)研究興起的同時，產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化的潛力也已初現(xiàn)。整體來看，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向又可以大體分為科研服務(wù)（測序分析、構(gòu)建）、IVD、CXO、****物研發(fā)等幾類，其中****物研發(fā)也被視為極具潛力的細(xì)分領(lǐng)域。“個人認(rèn)為，對標(biāo) mRNA，環(huán)狀 RNA 擁有無可比擬的優(yōu)勢，基因治療和新****開發(fā)將是其最具價值的方向。” 劉明說。
國外基于環(huán)狀 RNA 的測序公司包括 Arraystar、IntegrateRNA、CD Microarray、 Cofactor Genomics 等，其中 Arraystar 公司曾推出全球首款商業(yè)化的環(huán)狀 RNA 芯片。
根據(jù)不完全資料統(tǒng)計(jì)，目前國內(nèi)涉及環(huán)狀 RNA 相關(guān)方向的公司，90% 的公司以上融資規(guī)模較小，近 70% 的公司主要業(yè)務(wù)以科研服務(wù)為主，近 30% 的公司以環(huán)狀 RNA 為標(biāo)志物來檢測疾病，布局 CXO 服務(wù)的有銳博生物、吉賽生物。
在****物研發(fā)領(lǐng)域，全球整體產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展較慢，其中美國環(huán)狀 RNA 進(jìn)展最快，今年上半年走出兩家初創(chuàng)公司 Orna Therapeutics 和 Laronde，且融資金額屢創(chuàng)新高。這兩家環(huán)狀 RNA 公司均由知名 VC 孵化而來，含著 “金湯匙” 出生；國內(nèi)在環(huán)狀 RNA ****物研發(fā)領(lǐng)域與美國相差不大，但環(huán)狀 RNA ****物研發(fā)公司整體披露的信息比較少，現(xiàn)已披露的公司有 2010 年成立的吉賽生物，2021 年成立的環(huán)碼生物，融資規(guī)模比較小。
公開資料顯示，半年內(nèi)全球環(huán)狀 RNA 領(lǐng)域累計(jì)獲得超 6 億融資，美國兩家公司獨(dú)占 5.7 億美元，國內(nèi)環(huán)碼生物斬獲千萬美元融資，吉賽生物暫未融資。

Orna Therapeutics 帶著 8000 萬美元亮相之際，背后站著知名 VC 和 BMS、Kite、諾華生物醫(yī)學(xué)研究所等制****大廠。該公司的創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)為 Alex Wesselhoeft 和 Dan Anderson 領(lǐng)銜的 MIT 團(tuán)隊(duì)，他們在 2018 年、2019 年取得一系列進(jìn)展，相關(guān)成果也發(fā)布在《自然》和《細(xì)胞》上。作為全球首家環(huán)狀 RNA ****物研發(fā)公司，該公司將其開發(fā)的環(huán)狀 RNA 稱之為 oRNA，他們認(rèn)為 oRNA 相當(dāng)于 mRNA2.0 版，在生產(chǎn)、遞送和治療效果方面更具有優(yōu)勢。
3 個月后，Laronde 也正式亮相，他們將其開發(fā)的環(huán)狀 RNA 稱之為 “eRNA”，Laronde 的目標(biāo)是在未來 10 年內(nèi)生產(chǎn) 100 種基于 eRNA 的****物。
同年，國內(nèi)環(huán)狀 RNA 初創(chuàng)公司環(huán)碼生物成立，并于今年 6 月完成了千萬美元天使輪融資。該公司由中科院營養(yǎng)與健康研究所教授、中科院計(jì)算生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、RNA 系統(tǒng)生物學(xué)課題組組長王澤峰教授創(chuàng)辦。他在環(huán)狀 RNA 調(diào)控機(jī)制和工程化應(yīng)用方面具備一定研究成果和技術(shù)積淀；中科院上海營養(yǎng)與健康研究所副研究員楊赟博士是環(huán)碼生物的共同創(chuàng)始人兼 CTO，他在 RNA 體外環(huán)化和環(huán)狀 RNA 翻譯效率調(diào)控等方面同樣具有多年基礎(chǔ)研究和技術(shù)開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。
吉賽生物則是一家成立 11 年之久的環(huán)狀 RNA 產(chǎn)研服務(wù)公司，同時也是國內(nèi)最早布局環(huán)狀 RNA 的公司。該公司最初以提供環(huán)狀 RNA 基因治療的 CRO 和 CDMO 服務(wù)起家，主要聚焦環(huán)狀 RNA 核心技術(shù)和完備的環(huán)狀 RNA 研究體系。今年 8 月，劉明在接受媒體采訪時透露除了環(huán)狀 RNA CRO 服務(wù)以外，吉賽生物還將基于前期發(fā)現(xiàn)具有重大功能的環(huán)狀 RNA 翻譯產(chǎn)物開發(fā)疾病治療靶點(diǎn)。
“總體來看，無論是線性 RNA 還是環(huán)狀 RNA 都才剛剛起步，上游技術(shù)和科研成果的儲備尤其重要。如果新冠疫情還未得到很好控制，而且環(huán)狀 RNA 疫苗比目前疫苗的免疫效果更好，環(huán)狀 RNA 可能會得到很好很快的應(yīng)用?！?劉明說。

盡管環(huán)狀 RNA 優(yōu)勢明顯，產(chǎn)業(yè)化潛力巨大，但也有諸多問題需要解決。
史家海告訴生輝，環(huán)狀 RNA 目前面臨的首要問題是環(huán)化效率低；其次，環(huán)狀 RNA 沒有 5‘端的帽子結(jié)構(gòu)，所以需要內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)作為啟動區(qū)域，但是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的效率沒有帽子的效率高。史家海表示正在開發(fā) RNA 復(fù)制酶以解決 RNA 連接缺口不平的問題。
在過去幾年間，環(huán)碼基因王澤峰實(shí)驗(yàn)室也一直專注于環(huán)形 RNA 的翻譯效率上。此外，該實(shí)驗(yàn)室也在深入研究 AI，以便通過序列設(shè)計(jì)來提高相關(guān)性能。
至于其在未來應(yīng)用上是否會超越線性 RNA，史家海直言，“如果是需要提高表達(dá)量的應(yīng)用，環(huán)狀 RNA 效果會更好。”
在產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化上，精準(zhǔn)快速的環(huán)狀 RNA 制備仍然是技術(shù)難題。劉明告訴生輝，“目前環(huán)狀 RNA 制備的主流技術(shù)主要是體外轉(zhuǎn)錄后自剪切形成環(huán)狀 RNA。此方法制備的環(huán)化 RNA 也會參入無關(guān)序列，影響環(huán)狀 RNA 天然結(jié)構(gòu)和獨(dú)特功能；另外使用連接酶進(jìn)行 RNA 的環(huán)化連接，會產(chǎn)生相當(dāng)多的聚合副產(chǎn)物，實(shí)際合成以及后續(xù)的產(chǎn)物純化回收過程較復(fù)雜，導(dǎo)致制備效率低，不利于產(chǎn)業(yè)化。另外，規(guī)模化量產(chǎn)也是產(chǎn)業(yè)化的難題之一。”
需要注意的是，今年 7 月，Cell Reports 在線發(fā)表了上海交通大學(xué) Bio-X 研究院 PI 胥川博士和美國密西根大學(xué)張建之教授關(guān)于哺乳動物環(huán)狀 RNA 的研究。
該研究給出了一系列證據(jù)表明環(huán)狀 RNA 大部分源自于剪接錯誤，并估算出超過 97% 環(huán)狀 RNA 是無用甚至有害的，他們認(rèn)為絕大多數(shù)環(huán)狀 RNA 是垃圾 RNA。但這與少數(shù)環(huán)狀 RNA 被證實(shí)具有功能的事實(shí)并不矛盾。
參考資料：

• http://news.sciencenet.cn/htmlpaper/2021/8/202182016253068065868.shtm

• https://www.researchgate.net/publication/332677132_The_emerging_roles_and_functions_of_circular_RNAs_and_their_generation

• https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00856-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124721008561%3Fshowall%3Dtrue