諾獎得主Ardem Patapoutian丨Piezo1的發(fā)現(xiàn)用了一年，開發(fā)更高通量系統(tǒng)，尋找更多機械敏感蛋白

Patapoutian 發(fā)現(xiàn)的 Piezo1 和 Piezo2 離子通道在觸覺、運動感知、血壓、呼吸和膀胱控制等生理過程中起重要作用。
而除了離子通道之外，Patapoutian 還發(fā)現(xiàn)了另一類壓力傳感器， G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 中一種叫做 GPR68 的蛋白，在小直徑（阻力）動脈的內(nèi)皮細胞中表達，可作為剪切應(yīng)力傳感器，是心血管病理生理學中的關(guān)鍵信號組件。
這篇題為 “GPR68 senses flow and is essential for vascular physiology” 的文章于 2019 年發(fā)表在 Cell 上。高通量篩選出 GPR68 基因

在發(fā)現(xiàn) Piezo1 的實驗中，該團隊進行了功能基因組小干擾 RNA (siRNA) 篩選，使用薄膜壓痕和電生理記錄，這是一個低通量篩選，該團隊用了近一年時間，在篩選了 72 個候選基因后，才最終確定了 Piezo1 基因。
為了加速與機械轉(zhuǎn)導相關(guān)的基因組篩選，團隊重新設(shè)計了一種新型的 384 孔高通量 (HT) 機械刺激系統(tǒng)，并使用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 Piezo1 基因驗證了該系統(tǒng)的準確性和可行性。

研究人員通過初篩，選擇了對剪切力變化最敏感的乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 進行實驗，將該細胞的 Piezo1 和 Piezo2 基因敲低，發(fā)現(xiàn)并不影響細胞的剪切應(yīng)力響應(yīng)，說明該細胞還存在其它分子負責傳感剪應(yīng)力。
于是研究人員針對編碼具有兩個或多個預測跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)基因構(gòu)建了 siRNA 文庫，該文庫包含 21,925 個獨特的 siRNA，靶向由 2,765 個獨特基因編碼的 3,175 個獨特參考序列。

最終研究人員確定了 GPR68 基因，該基因敲低會導致細胞對剪切應(yīng)力響應(yīng)程度下降。GPR68 被描述為質(zhì)子激活的 GPCR，實驗結(jié)果也表明 MDA-MB-231 細胞在 pH 值 7.4-6.9 時（正常動脈血 pH 值約為 7.4，6.9 代表嚴重酸中毒）對剪切應(yīng)力響應(yīng)最敏感，表明 GPR68 確實需要質(zhì)子的存在才能感知剪切應(yīng)力。
研究還發(fā)現(xiàn)，GPR68 與其他已知的機械敏感性 GPCR 不同，在同等條件刺激下，僅有 GPR68 能產(chǎn)生響應(yīng)，其它受體均無任何反應(yīng)，說明了 GPR68 對剪切應(yīng)力的獨特敏感性。

在模擬血液層流測試中，GPR68 也能夠?qū)毫Υ碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)，而其它與層流傳感器有關(guān)的蛋白質(zhì)則無響應(yīng)。GPR68 的血管生理作用

研究確定了 Gpr68 優(yōu)先在小直徑阻力動脈中表達，小直徑阻力動脈是調(diào)節(jié)血流阻力的主要部位，表明 Gpr68 可能在血流介導的血管舒張中發(fā)揮作用。
為了測試這一點，研人員從純合 Gpr68-eGFP 小鼠的大腦中分離出小鼠原代微血管內(nèi)皮細胞 (MVEC)，并測定它們對流動室中剪切應(yīng)力的反應(yīng)。隨著壓強逐漸增加，表達 Gpr68 的內(nèi)皮細胞通過增加細胞內(nèi)鈣水平對流動作出反應(yīng)，降低其基因表達水平后，反應(yīng)消失。這些結(jié)果表明 MVEC 細胞中的內(nèi)源性 Gpr68 是剪切應(yīng)力響應(yīng)所必需的。

然后研究人員從 Gpr68 基因敲除鼠中分離了腸系膜動脈 (MA) 并進行了體外插管實驗，使用去氧腎上腺素刺激血管收縮，發(fā)現(xiàn)其 3 階（研究將腸系膜動脈由主支到分支，由粗到細分為 1、2、3 階）血管的收縮程度顯著低于正常小鼠，1、2 階血管沒有明顯差別。
研究人員繼續(xù)使用了一種名為 Ogerin 的 GPR68 變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（可以特異性調(diào)節(jié)人和小鼠 GPR68 的活性）刺激血管，如預想一樣，Ogerin 可以刺激正常小鼠 3 階血管的劑量依賴性擴張，但 Gpr68 基因敲除鼠的血管在 1 nM 到 1 μM 的 Ogerin 濃度范圍內(nèi)沒有擴張反應(yīng)。
上述結(jié)果說明，Gpr68 基因是體外小鼠小直徑腸系膜動脈的流動介導的擴張反應(yīng)所必需的。
研究人員還證明了在血管缺血情況下，GPR68 可促進旁支血管直徑增大，介導血流量增加引起的血管外向重塑 ，同樣這一作用也只限定于小直徑動脈。
綜上所述，研究人員證明了 GPR68 是小動脈內(nèi)皮中必不可少的流量傳感器。
文章最后指出，高通量剪切應(yīng)力刺激系統(tǒng)極大地提高了機械轉(zhuǎn)導分析的通量，這種使能技術(shù)使得對新型機械敏感蛋白和通路進行無偏見的全基因組篩選成為可能。新型機械傳感器 GPR68 的鑒定驗證了這一創(chuàng)新系統(tǒng)的價值和潛力，并擴展了在體內(nèi)感知機械力的膜蛋白庫。

參考資料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5951615/
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