諾獎(jiǎng)得主Ardem Patapoutian丨Piezo1的發(fā)現(xiàn)用了一年，開發(fā)更高通量系統(tǒng)，尋找更多機(jī)械敏感蛋白

Patapoutian 發(fā)現(xiàn)的 Piezo1 和 Piezo2 離子通道在觸覺、運(yùn)動(dòng)感知、血壓、呼吸和膀胱控制等生理過(guò)程中起重要作用。
而除了離子通道之外，Patapoutian 還發(fā)現(xiàn)了另一類壓力傳感器， G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 中一種叫做 GPR68 的蛋白，在小直徑（阻力）動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，可作為剪切應(yīng)力傳感器，是心血管病理生理學(xué)中的關(guān)鍵信號(hào)組件。
這篇題為 “GPR68 senses flow and is essential for vascular physiology” 的文章于 2019 年發(fā)表在 Cell 上。高通量篩選出 GPR68 基因

在發(fā)現(xiàn) Piezo1 的實(shí)驗(yàn)中，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了功能基因組小干擾 RNA (siRNA) 篩選，使用薄膜壓痕和電生理記錄，這是一個(gè)低通量篩選，該團(tuán)隊(duì)用了近一年時(shí)間，在篩選了 72 個(gè)候選基因后，才最終確定了 Piezo1 基因。
為了加速與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因組篩選，團(tuán)隊(duì)重新設(shè)計(jì)了一種新型的 384 孔高通量 (HT) 機(jī)械刺激系統(tǒng)，并使用已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 Piezo1 基因驗(yàn)證了該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和可行性。

研究人員通過(guò)初篩，選擇了對(duì)剪切力變化最敏感的乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將該細(xì)胞的 Piezo1 和 Piezo2 基因敲低，發(fā)現(xiàn)并不影響細(xì)胞的剪切應(yīng)力響應(yīng)，說(shuō)明該細(xì)胞還存在其它分子負(fù)責(zé)傳感剪應(yīng)力。
于是研究人員針對(duì)編碼具有兩個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)基因構(gòu)建了 siRNA 文庫(kù)，該文庫(kù)包含 21,925 個(gè)獨(dú)特的 siRNA，靶向由 2,765 個(gè)獨(dú)特基因編碼的 3,175 個(gè)獨(dú)特參考序列。

最終研究人員確定了 GPR68 基因，該基因敲低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)剪切應(yīng)力響應(yīng)程度下降。GPR68 被描述為質(zhì)子激活的 GPCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明 MDA-MB-231 細(xì)胞在 pH 值 7.4-6.9 時(shí)（正常動(dòng)脈血 pH 值約為 7.4，6.9 代表嚴(yán)重酸中毒）對(duì)剪切應(yīng)力響應(yīng)最敏感，表明 GPR68 確實(shí)需要質(zhì)子的存在才能感知剪切應(yīng)力。
研究還發(fā)現(xiàn)，GPR68 與其他已知的機(jī)械敏感性 GPCR 不同，在同等條件刺激下，僅有 GPR68 能產(chǎn)生響應(yīng)，其它受體均無(wú)任何反應(yīng)，說(shuō)明了 GPR68 對(duì)剪切應(yīng)力的獨(dú)特敏感性。

在模擬血液層流測(cè)試中，GPR68 也能夠?qū)毫Υ碳ぎa(chǎn)生響應(yīng)，而其它與層流傳感器有關(guān)的蛋白質(zhì)則無(wú)響應(yīng)。GPR68 的血管生理作用

研究確定了 Gpr68 優(yōu)先在小直徑阻力動(dòng)脈中表達(dá)，小直徑阻力動(dòng)脈是調(diào)節(jié)血流阻力的主要部位，表明 Gpr68 可能在血流介導(dǎo)的血管舒張中發(fā)揮作用。
為了測(cè)試這一點(diǎn)，研人員從純合 Gpr68-eGFP 小鼠的大腦中分離出小鼠原代微血管內(nèi)皮細(xì)胞 (MVEC)，并測(cè)定它們對(duì)流動(dòng)室中剪切應(yīng)力的反應(yīng)。隨著壓強(qiáng)逐漸增加，表達(dá) Gpr68 的內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣水平對(duì)流動(dòng)作出反應(yīng)，降低其基因表達(dá)水平后，反應(yīng)消失。這些結(jié)果表明 MVEC 細(xì)胞中的內(nèi)源性 Gpr68 是剪切應(yīng)力響應(yīng)所必需的。

然后研究人員從 Gpr68 基因敲除鼠中分離了腸系膜動(dòng)脈 (MA) 并進(jìn)行了體外插管實(shí)驗(yàn)，使用去氧腎上腺素刺激血管收縮，發(fā)現(xiàn)其 3 階（研究將腸系膜動(dòng)脈由主支到分支，由粗到細(xì)分為 1、2、3 階）血管的收縮程度顯著低于正常小鼠，1、2 階血管沒有明顯差別。
研究人員繼續(xù)使用了一種名為 Ogerin 的 GPR68 變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（可以特異性調(diào)節(jié)人和小鼠 GPR68 的活性）刺激血管，如預(yù)想一樣，Ogerin 可以刺激正常小鼠 3 階血管的劑量依賴性擴(kuò)張，但 Gpr68 基因敲除鼠的血管在 1 nM 到 1 μM 的 Ogerin 濃度范圍內(nèi)沒有擴(kuò)張反應(yīng)。
上述結(jié)果說(shuō)明，Gpr68 基因是體外小鼠小直徑腸系膜動(dòng)脈的流動(dòng)介導(dǎo)的擴(kuò)張反應(yīng)所必需的。
研究人員還證明了在血管缺血情況下，GPR68 可促進(jìn)旁支血管直徑增大，介導(dǎo)血流量增加引起的血管外向重塑 ，同樣這一作用也只限定于小直徑動(dòng)脈。
綜上所述，研究人員證明了 GPR68 是小動(dòng)脈內(nèi)皮中必不可少的流量傳感器。
文章最后指出，高通量剪切應(yīng)力刺激系統(tǒng)極大地提高了機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)分析的通量，這種使能技術(shù)使得對(duì)新型機(jī)械敏感蛋白和通路進(jìn)行無(wú)偏見的全基因組篩選成為可能。新型機(jī)械傳感器 GPR68 的鑒定驗(yàn)證了這一創(chuàng)新系統(tǒng)的價(jià)值和潛力，并擴(kuò)展了在體內(nèi)感知機(jī)械力的膜蛋白庫(kù)。

參考資料：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5951615/
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