ACS Synthetic Biology丨開發(fā)人體腸道擬桿菌的基因組編輯新工具

團隊成員鄭靈剛和譚揚為共同第一作者，該工作得到了國家重點研發(fā)計劃合成生物學(xué)重點專項青年科學(xué)家項目（No.2019YFA0906700）與深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的資助。   腸道擬桿菌屬是腸道中豐度最高的細(xì)菌之一（如圖1所示），被視為研究腸道微生物組的“窗口”。


擬桿菌屬與多種疾病相關(guān)，比如肥胖，炎癥性腸病和結(jié)直腸癌等，其中多形擬桿菌和脆弱擬桿菌最為受到關(guān)注?；蚪M編輯工具對于研究腸道共生微生物的功能至關(guān)重要。因此，該團隊設(shè)計了針對人體腸道擬桿菌的多功能、高效的 CRISPR/Cas 編輯工具（如圖2所示）。
 該團隊在擬桿菌屬中測試了不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)。主要評估了啟動子，Cas蛋白（SpCas9，SpRY，和FnCas12a），gRNA等元件，以及不同質(zhì)粒的系統(tǒng)對于擬桿菌屬基因編輯的影響。并發(fā)現(xiàn)在多形擬桿菌中采用正常組成型啟動子表達(dá)Cas蛋白，CRISPR/Cas系統(tǒng)無法實現(xiàn)編輯，但是使用誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)Cas蛋白，均可以實現(xiàn)基因編輯；其中FnCas12a效果最好。基于此，團隊測試該系統(tǒng)在多形擬桿菌中可以實現(xiàn)5kb、10kb、48kb基因簇片段的刪除和外源基因GFP的高效插入。此外，也可通過在無篩選標(biāo)記的培養(yǎng)基中傳代，進(jìn)行含有篩選標(biāo)記的質(zhì)粒的丟失，實現(xiàn)獲得“無篩選標(biāo)記（markerless）”的突變株（如圖3所示）。
 除此之外，該系統(tǒng)也可以在卵形擬桿菌（Bo），脆弱擬桿菌（Bf），普通擬桿菌（Bv），和單形擬桿菌（Bu）實現(xiàn)高效率的基因刪除。（如圖4所示)
 與之前針對擬桿菌屬基因基因遺傳操作工具相比，該團隊基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的工具極大的提高了擬桿菌屬基因編輯的效率，同時也更容易實現(xiàn)無篩選標(biāo)記突變株的獲得。高效、精準(zhǔn)的基因組編輯方法對于解析腸道微生物組的功能、開發(fā)工程腸道益生菌都是不可或缺的工具。
文丨鄭靈剛編輯丨趙梓杉